[发明专利]用于氨基酸消耗疗法的组合物和方法

说明书

提供了用于制备高纯度精氨酸酶以及用于高效制备单取代聚乙二醇化精氨酸酶缀合的组合物和方法，以及使用精氨酸酶与天冬酰胺酶组合抑制癌细胞的方法。通过应用初始高温沉淀步骤，然后进行离子交换，以提供纯度为90％或更高的精氨酸酶来提供高纯度精氨酸酶。使用相对于精氨酸酶较低摩尔过量的马来酰亚胺衍生的聚乙二醇和在降低的温度下进行与直链或支链的聚乙二醇的缀合。这种聚乙二醇衍生的精氨酸酶与天冬酰胺酶组合在抑制癌细胞，特别是具有较低的内源性天冬酰胺酶表达的细胞的生长中是有用的。

本申请要求2017年8月16日提交的美国临时申请号62/546489和2017年11月27日提交的美国临时申请号62/591102的权益。这些以及所有其他参考的外部材料通过引用以其全部并入本文。在通过引用并入的参考文献中术语的定义或使用与本文提供的术语的定义不一致或相反的情况下，认为以本文提供的该术语的定义为准。

技术领域

本发明的领域是精氨酸酶纯化、精氨酸酶修饰以及精氨酸酶和天冬酰胺酶的医学用途。

背景技术

以下描述包括在理解本发明中可能有用的信息。并不是承认本文提供的任何信息是现有技术或与当前要求保护的发明有关，或明确或隐含引用的任何出版物均为现有技术。

越来越多的证据表明氨基酸剥夺可能是治疗癌症的有效候选。已经发现剥夺特定氨基酸(比如精氨酸、天冬酰胺或谷氨酰胺)可用于治疗不同类型的癌症(Feun,You etal.2008；Hensley,Wasti et al.2013；Krall,Xu et al.2016)。本文中的所有出版物通过引用并入，其引用程度与每个单独的出版物或专利申请被明确且单独地指示通过引用并入的程度相同。当在并入的参考文献中术语的定义或使用与本文提供的术语的定义不一致或相反时，适用本文提供的该术语的定义，而参考文献中该术语的定义不适用。氨基酸剥夺的有效性被认为是由于下游效应，比如mTORC1的失活和蛋白质合成的破坏。

重组人精氨酸酶(rhArg)应用于消耗精氨酸已显示在体外抑制癌细胞生长方面有效(Lam,Wong et al.2009；Tsui,Lam et al.2009)。选择精氨酸作为靶标氨基酸不仅是因为其在蛋白质合成中的半必需作用，而且还因为精氨酸在激活mTORC1中的作用(Carroll,Maetzel et al.2016；Chantranupong,Scaria et al.2016；Krall,Xu et al.2016；Saxton,Chantranupong et al.2016；Zheng,Zhang et al.2016)。发现精氨酸剥夺可以有效抑制各种癌细胞系，包括源自乳腺癌、结肠癌、肺癌和宫颈癌的细胞系。

酶精氨酸酶作用于精氨酸以产生鸟氨酸和尿素，并且是尿素循环的一部分。精氨酸酶被发现越来越多地用作化学治疗剂，其中其被用于降低血清中的精氨酸浓度。这些消耗的血清精氨酸水平可以有效地使癌细胞“饿死”(其许多变种都是在精氨酸方面存在营养缺陷的)。

使用精氨酸酶作为治疗剂需要大量和高纯度的人精氨酸酶的可用性。已经尝试提供高度纯化的重组人精氨酸酶。例如，美国专利号8,507,245(授予Leung和Lo)描述了一种用于纯化重组人精氨酸酶1的伪亲和色谱法，该重组人精氨酸酶1已被修饰以提供聚乙二醇化的单一位点。然而，所描述的方法限于包括聚组氨酸序列的形式，该序列允许与金属伪亲和介质复合形成。该伪亲和介质用于亲和力纯化步骤，该亲和力纯化步骤是在缀合反应中使用大量过量的反应性PEG类似物所必需的。这样，如果不另外进行去除聚组氨酸序列的处理，通过这种方法纯化的精氨酸酶1不能被认为是完全人类的。