[发明专利]由多能干细胞向肝细胞的分化诱导方法

说明书

本发明以制作在许多方面与原代培养肝细胞类似的成熟的肝细胞为目的，提供由多能干细胞制作肝细胞或能够分化成肝细胞的细胞的方法，其特征在于，包括以下工序(1)～(4)：(1)用包含激活蛋白受体样激酶‑4,7的激活剂的培养基培养多能干细胞，(2)用包含成骨因子和成纤维细胞生长因子的培养基培养由工序(1)得到的细胞，(3)用包含肝细胞生长因子受体的激活剂和抑癌蛋白M受体的激活剂的培养基培养由工序(2)得到的细胞，(4)培养由工序(3)得到的细胞，获得肝细胞或能够分化成肝细胞的细胞，在工序(2)、(3)和(4)中的至少一个工序中，在高密度胶原蛋白凝胶膜上培养细胞。

技术领域

本发明涉及肝细胞或能够分化成肝细胞的细胞的制作方法、肝细胞或能够分化成肝细胞的细胞、以及应用所述肝细胞的被检验物质的特性评价方法。

背景技术

许多药剂通过被肝脏代谢而或药效改变，或显示毒性。因此，当药品开发时，有必要检查药物候选物质对肝脏的毒性。现在肝毒性的评价进行利用小鼠等实验动物的体内(in vivo)试验、利用人原代培养肝细胞的体外(in vitro)试验等。但是，由于利用实验动物的试验具有“种间差异的障碍”，因而难以正确评价对人肝细胞的毒性，从动物保护的观点考虑也不优选。另一方面，人原代培养肝细胞存在供给受到限制、批次差异大等问题，或从培养开始在短时间药剂代谢酶的活性降低的问题。

ES细胞、iPS细胞等多能干细胞具有向包含肝细胞在内的任意体细胞分化的能力。如果能够使人来源的多能干细胞向成熟的肝细胞分化，利用其进行肝毒性试验，就能够解决上述的问题。因此，强烈希望开发出由人多能干细胞来分化诱导成熟肝细胞的技术。

对于由人多能干细胞向成熟肝细胞分化诱导的技术，以前有几个报告。例如本发明者报告了将纳米纤维作为支架材料使用的肝细胞的分化方法(非专利文献1)。

现有技术文献

非专利文献

非专利文献1:Yamazoe et al.,2013,J.Cell Sci.126,5391-9

发明内容

发明要解决的课题

通过非专利文献1中记载的方法得到的肝细胞虽然以高水平表达ALB、SERPINA1等分化标志物，但是转运体、代谢酶的表达水平不够。

在这样的背景下，本发明的目的在于，提供制作在许多方面与原代培养肝细胞类似的成熟的肝细胞的手段。

用于解决课题的手段

本发明者为了解决上述课题而反复深入研究，结果发现通过在CollagenVitrigel(注册商标)膜上培养由iPS细胞诱导的内胚层细胞，能够获得成熟度高的肝细胞。

Collagen Vitrigel在各种各样的细胞培养中使用，也有在与肝脏相关的细胞中使用的例子。例如有利用Collagen Vitrigel培养属于人肝癌来源的细胞的HepG2的报告(Oshikata-Miyazaki and Takezawa,2016,Cytotechnology 68,1801-1811)。但是，没有培养内胚层细胞这样的分化过程中的细胞的报告，此外，也没有通过这样的培养形成肝细胞的成熟度高的肝细胞的报告。

本发明是基于以上见解而完成的。

即，本发明提供以下〔1〕～〔9〕。

〔1〕由多能干细胞制作肝细胞或能够分化成肝细胞的细胞的方法，其特征在于，包括以下工序(1)～(4)，并且在工序(2)、(3)和(4)中的至少一个工序中，在高密度胶原蛋白凝胶膜上培养细胞，

工序(1)，用包含激活蛋白受体样激酶-4,7的激活剂的培养基培养多能干细胞，

工序(2)，用包含成骨因子和成纤维细胞生长因子的培养基培养由工序(1)得到的细胞，