[发明专利]用于鉴定免疫细胞特别是PD1+细胞的作为表观遗传标志物的PDCD1

说明书

本发明涉及一种用于鉴定PD1+细胞的方法，特别是一种体外方法，包括分析哺乳动物的程序性细胞死亡1(PDCD1)基因区中至少一个CpG位置的甲基化状态，其中，与非PD1+细胞相比，所述基因区的去甲基化或缺乏甲基化指示PD1+细胞。根据本发明的分析可以在表观遗传水平上鉴定PD1+细胞，并将其与复杂样品中的所有其他细胞(例如其他血液细胞或免疫细胞)区分开来。本发明还提供了一种用于定量PD1+细胞(特别是在复杂样品中)的改进方法。该方法可以在没有纯化和/或富集细胞的步骤的情况下，优选在全血和/或非胰蛋白酶化组织中进行。

本发明涉及一种用于鉴定PD1+细胞的方法，特别是一种体外方法，包括分析哺乳动物的程序性细胞死亡1(PDCD1)基因区中至少一个CpG位置的表观遗传修饰/特性(包括甲基化状态)，其中与非PD1+细胞相比，所述基因区的去甲基化或缺乏甲基化指示PD1+细胞。根据本发明的分析可以在表观遗传水平上鉴定PD1+细胞，并将其与复杂样品中的所有其他细胞(例如其他血液细胞或免疫细胞)区分开来。本发明还提供了一种用于定量PD1+细胞(特别是在复杂样品中)的改进方法。该方法可以在没有纯化和/或富集细胞的步骤的情况下，优选在全血和/或非胰蛋白酶化组织中进行。

此外，本发明涉及用于进行上述方法的试剂盒及其相应的用途。本发明的一个目的是提供一种新的、更强健的方法来定量检测和测量哺乳动物的任何实体器官或组织的血液、或体液中的PD1+细胞。

发明背景

通常，PD1+细胞被定义为主动合成由基因程序性细胞死亡1编码的蛋白质的细胞。在目前的应用中，PD1+细胞被定义为通过提供可获得的未修饰的原始DNA序列(如下文所述和定义的内含子区中的CpG基序没有修饰所示)而使其能够表达PD1的细胞。

PD1+细胞是表达程序性细胞死亡蛋白1(PDCD1，也被称为PD-1)的细胞。PDCD1表达于多种免疫细胞类型，如活化的胸腺来源的淋巴细胞(T淋巴细胞，T细胞)、前体B细胞、髓系来源的树突状细胞和自然杀伤(NK)细胞。PDCD1在免疫发育和炎症的多个不同阶段中表达，并且PDCD1是参与免疫调节和自我耐受的重要检查点受体。PDCD1的表达通过减少组织的滞留和细胞因子的产生，以及通过减少辅助细胞在早期免疫应答中的形成，减缓了初始急性抗原鉴定过程中的免疫应答。有趣的是，PDCD1能促进抗原特异性T细胞的凋亡(程序性细胞死亡)，同时抑制调节性T细胞(其是抗炎性T细胞)的凋亡。因此，PDCD1是有效获得性免疫应答的重要调控因子。

尽管在个体中几乎所有的细胞都含有完全相同的DNA密码的互补物，但较高等的生物体必须强加和维持多种组织类型中不同的基因表达模式。大多数基因调控是暂时性的，取决于细胞的当前状态和外部刺激的变化。另一方面，持续性调控是表观遗传学的主要作用——不会改变DNA的基本遗传编码的遗传性调控模式。DNA甲基化是表观遗传调控的典型形式；它作为细胞的稳定记忆，在维持各种细胞类型的长期同一性方面发挥着至关重要的作用。最近，发现了其他形式的表观遗传调控。除了“第五碱基”5-甲基胞嘧啶(mC)外，还可以找到第六碱基(5-羟甲基胞嘧啶，hmC)、第七碱基(5-甲酰基胞嘧啶，fC)和第八碱基(5-羧基胞嘧啶，cC)(Michael J.Booth等人，Quantitative Sequencing of 5-Methylcytosine and 5-Hydroxymethylcytosine at Single-Base Resolution Science，2012年5月18日,Vol.336no.6083pp.934-937)。

上述DNA修饰的主要目标是胞嘧啶鸟嘌呤(CpG位点)的双核苷酸序列；在这种情况下，胞嘧啶(C)可以经历简单的化学修饰以形成甲酰化、甲基化、羟甲基化或羧化。在人类基因组中，CG序列比预期的要稀少得多，除了在某些称为“CpG岛”的相对密集的集簇中。CpG岛通常与基因启动子相关，据估计，一半以上的人类基因有CpG岛(Antequera和Bind，ProcNatl Acad Sci USA 90：11995-9，1993)。