[发明专利]工程改造的细胞外囊泡的亲和纯化

说明书

本发明涉及细胞外囊泡(EV)的亲和色谱分离和纯化。本发明的EV被工程改造成能够与例如色谱基质进行高度特异性结合，这对于从复杂的生物液体(诸如细胞培养基或生物液体)中EV的基于亲和分离和纯化非常有用。

技术领域

本发明涉及细胞外囊泡(EV)治疗的亲和色谱分离和纯化，其中所述EV被工程改造成能够与例如色谱基质进行高度特异性结合并任选地进行随后洗脱。

背景技术

细胞外囊泡(EV)是纳米大小的囊泡(流体动力学直径通常小于1000纳米)，由产生EV的细胞释放到细胞外环境中。EV，并且特别是外泌体(是或通常由不同的参数定义，例如，流体动力学半径在30至120纳米之间，并且其在其膜中存在各种跨膜四蛋白)已经示出能够将蛋白生物(诸如抗体和诱饵受体)运输至靶细胞，从而使利用EV的特性与重组蛋白的特异性结合的一种全新形式的先进生物治疗成为可能。

制备和分离EV(例如，外泌体)的常规方法涉及一系列不同的离心步骤，以将囊泡从存在于培养基中的细胞或细胞碎片分离，其中所述EV由产生EV的细胞释放到培养基中。典型地，实施一系列离心，例如在300g、10,000g和70,000g或100,000g，然后用盐溶液将试管底部产生的沉淀物重悬至原始体积的一小部分，以构成浓缩的EV或外泌体溶液。然而，由于多种原因，这些方法基本上不适合于临床应用：(1)整个工艺所需时间过长，(2)在GMP环境中进行放大和验证的问题，(3)细胞碎片污染的重大风险，(4)由于操作员可变性导致的再现性差，(5)囊泡沉淀导致的EV/外泌体聚集，(6)加工结束时回收率低以及(7)对囊泡形态的负面影响并从而对生物分布和活性导致负面影响。因此，需要一种制备膜囊泡的改进工艺，所述工艺适合于工业上的限制并且允许生产治疗质量的囊泡制备。为此目的，PCT申请WO2000/044389公开了通过色谱技术(诸如阴离子交换色谱和/或凝胶渗透色谱)，从生物样品制备膜囊泡的工艺。WO2014/168548公开了一种用于EV的显著改进的分离和纯化方法，即使用过滤和各种形式的液相色谱的顺序组合(例如超滤和排阻液相色谱的组合)。然而，在上述公开内容上仍有很大改进的空间，尤其是随着EV治疗领域向基于EV治疗的临床转译和影响发展。

发明内容

因此，本发明的目的是克服与EV的分离和纯化有关的上述问题。此外，本发明旨在满足本领域中其他现有的需求，例如开发用于EV纯化的高产率和高特异性的普遍适用的亲和纯化策略。特别地，先前已知的纯化外泌体的方法不适合于大规模生产和放大，而这对于EV治疗的商业生产是必需的。本发明允许对工程改造的外泌体进行更大规模的高亲和纯化，这比先前已知的工艺更容易实现。

本发明通过利用包含Fc结构域的色谱基质实现了这些和其他目的，其中被工程改造成包含Fc结合多肽的EV附着在Fc结构域上。如此，本发明因此涉及用于分离和/或纯化EV的周围工艺的各个方面和实施例，典型地，其包含以下步骤：(i)使包含EV的培养基与包含Fc结构域的色谱基质接触，(ii)允许EV吸附到Fc结构域，以及(iii)通过使从Fc结构域释放EV的培养基穿过色谱基质来洗脱EV。如以上提及，本发明的EV被工程改造成包含并典型地在其表面上显示Fc结合多肽，诸如蛋白A、蛋白G、蛋白A/G、Z结构域、ZZ结构域(Z结构域的两个可操作连接的拷贝)、人FCGRI、人FCGRIIA、人FCGRIIB、人FCGRIIC、人FCGRIIIA、人FCGR3B、人FCAMR、人FCERA、人FCAR、小鼠FCGRI、小鼠FCGRIIB、小鼠FCGRIII、小鼠FCGRIV、小鼠FCGRn，以及各种组合、衍生物或其替代。

在进一步的方面，本发明涉及色谱基质结合EV的用途，其中所述色谱基质包含Fc结构域。在又一进一步的方面，本发明涉及包含至少一种Fc结合多肽的EV，其中所述EV可使用本发明的纯化/分离方法经由捕获或分离获得。此外，本发明还涉及包含至少一种融合蛋白的EV，其中所述至少一种融合蛋白包含与至少一种外泌体多肽融合的至少一种Fc结合多肽，其是非常有用的平台，能够纯化EV，例如用于治疗应用。