[发明专利]稳定同位素标记的核酸作为内标物的核酸定量方法及其用途

说明书

为了定量分析样品或者复杂介质内存在的核酸，核酸提取或者精制过程不要的。但是核酸提取及精制收率(yield)根据精制原理、使用的套组及样品的特性有很大的变动性。所以核酸的提取及精制收率的有效归一化(normalization)成为以原样品为基准的正确定量分析核酸的必要条件。本发明是有关没有目标核酸的增幅，对存在于样品或者复杂介质内的核酸进行定量分析的方法。

技术领域

本发明是有关提高了准确度和可靠性的核酸(Nucleic acids；DNA及RNA)的定量分析方法，具体是有关利用稳定同位素(stable isotope)标记的核酸(stable isotopelabelled nucleic acids(DNA or RNA)；以下称为'SILD')为内标物(internal standard)的核酸定量分析方法。

背景技术

基因分析包括根据PCR和排序(sequencing)技术扩增基因和分析其碱基序列过程。基因分析在以下领域中广泛被利用。如，疾病诊断、突变检测、病原性细菌和病毒的检测等医学领域；基因变形农产品检测，食材原产地判别，污染于食材的微生物检测等食品及卫生领域；如微生物群集分析、对生物体的毒性分析、生物多样性保存的环境领域；亲子判别、个人识别、犯罪嫌疑人识别等法医领域。

通过新一代碱基测序(next generation sequencing；NGS)技术开发，可对数十、数百个不同样品，也可进行同时对数千、数万个遗传基因分析的高效率遗传基因组(genome)分析。NGS技术在很多领域有效被利用。包括根据全转录组测序的所有遗传基因表达谱分析及大规模、高精密度微生物群集分析；根据同类群组分析的集团遗传特性和疾病标记发掘；根据个人遗传基因分析的疾病预测等个体化医学等领域。

最近血液内‘循环核酸或者自由核酸(circulating cell free nucleic acid)’被发现。通过后续研究还发现了循环核酸具有很大的医学意义，因此为了利用循环核酸的精密分析法的必要性突显。

在正常状态下血液中的循环核酸的量为20-100ng/ml,但是如果发生乳房癌、血癌等癌症的时候会出现大幅增加到200-500ng/ml的现象。具有些报告显示不仅对癌症在心肌梗塞、感染、急性炎症、过度运动及压力中也会出现循环核酸量变化的现象。即具有了单纯只通过测定血液中的循环核酸量也可以早期诊断主要疾病的可能性。为此，首先需要对血液中循环核酸进行正确并可靠的定量分析。

核酸定量法一般使用紫外光谱法(UV spectrometry)定量聚合酶链反应(quantitative real time polymerase chain reaction；qPCR)数码聚合酶链反应(digital PCR)及荧光定量法等。所述定量法因为受到样品或者介质中存在的其他成分的阻碍，没有精制过程时无法正确定量分析核酸的量。但是对于复杂介质中的核酸，准确度和可靠性高的定量分析法还没被开发出来。

专利文献1公开了一种核酸的定量方法。该核酸定量方法以如下阶段构成。把与样品中的被分析物质核酸能区分并且能和该核酸同时能扩增的多种核酸构建体，以不同量各添加到样品里的阶段；使用能与所述被分析物质核酸和核酸构建体反应的扩增试剂，把所述样品以核酸扩增步骤来处理的阶段；从所述相对量计算被分析物质核酸量的阶段。所述各个核酸构件体都不同；各个核酸构建体可以区分开来并且也能与被分析物质核酸也能区分开来。核酸构建体在能与相同的扩增试剂反应的这一特点，与核酸构建体和被分析物质核酸类似。

但是所述方法会根据在校准曲线制作中的使用的各种核酸构建体的分析中的核酸而发生变化，并且核酸构建体具有要与被分析物相同速度扩增的前提，因此不能认为是具有可靠的定量分析方法。

专利文献2公开了一种有关为生成校正曲线而可计算目标核酸的特性水平的，一般的基准核酸的使用。专利文献2是有关导入被标识为公示量荧光段的普遍基准核酸的定量方法。这与专利文献1一样，因具有用在校准曲线的核酸要以相同速度扩增的前提，所以存在基本错误。