[发明专利]酸介导的分析配体-药物偶联物的测定法

说明书

本文提供了使用酸介导的裂解分析配体‑药物偶联物的方法和用于实施该方法的方法。还提供了包括用于分析和开发配体‑药物偶联物的方法的各种应用。

相关申请的交叉引用

本申请要求2017年11月22日提交的美国专利申请62/590,169的权益，出于所有目的将其公开内容整体合并于此。

背景技术

配体-药物偶联物(LDC)是针对靶向疗法日益增长的关注焦点。LDC由经由接头连接在一起的细胞毒性剂(通常是具有高全身毒性的小分子药物)和对组织或细胞特异性抗原(例如抗体-药物偶联物(ADC)情况下的抗体)的高选择性配体组成，其在循环中相对稳定，但在目标环境中释放细胞毒性剂。抗体-药物偶联物(ADC)作为下一代靶向疗法具有广阔的前景，尤其是在肿瘤学领域。利用抗体的免疫学特异性将强效的细胞毒性剂传递给患病组织，既可以提高抗肿瘤活性，又可以限制靶标毒性。这种方法目前已经在两种FDA批准的ADC中成功使用，即本妥昔单抗(brentuximab vedotin)和曲妥珠单抗-美坦新(ado-trastuzumab emtansine)(Verma等人，2012,Younes等人，2010)，并且是许多临床前研究和临床试验的重点。

大量的研究工作一直致力于改善LDC的药代动力学属性、毒性和化学稳定性。大多数LDC是可变地负荷药物的配体的异质混合物，这意味着可以将数量不定的药物或药物-接头分子连接到一个配体上。一旦将LDC置于生物环境中，就会发生生物转化，例如药物或药物-接头的丢失，从而导致进一步的异质性。尽管大多数ADC使用酰胺和硫醚化学方法通过内源赖氨酸和半胱氨酸残基将有效的细胞毒性剂与抗体连接，并且马来酰亚胺-半胱氨酸偶联已用于许多临床阶段ADC程序，但马来酰亚胺已显示出一定程度的偶联后不稳定性。因此，需要具有改善的药物-抗体连接稳定性的LDC，以确保药物的靶标特异性递送并限制靶标毒性。

改进的LDC的这种发展通常需要多种生物分析测定。可以通过使用各种分析方法测量随时间推移或暴露于生物环境后稳定偶联到配体上的药物的浓度来测定生物转化以及药物或药物-接头的稳定性。此类测定需要释放药物或其部分以进行后续测量的手段。这可以通过酶促裂解来完成。但是，某些药物和药物-接头不能被酶裂解。因此，需要从LDC切割药物和药物-接头的替代方法，其适合与用于检测和定量释放的药物或其部分的适当分析方法一起使用。

发明内容

本公开提供了测量、分析和定量样品中的LDC，从而确定偶联至配体的药物的量的方法。具体地，该方法使用包含分析目标的LDC，该分析目标可通过用酸例如含水三氟乙酸(TFA)处理而从LDC释放。还提供了基于从LDC释放的分析目标的测量值确定LDC的量、浓度和稳定性的方法。本文提供的分析LDC的方法可以是开发具有更好的稳定性和更少的毒性的新型LDC的必要工具。

更具体地说，一方面，本发明提供了一种分析样品中的配体-药物偶联物(LDC)的方法，其包括以下步骤：(a)提供包含LDC的样品，其中所述LDC包含配体和分析目标，其中分析目标包括药物分子或其一部分；和(b)使样品与浓度为1-30％(v/v)的含水三氟乙酸(TFA)接触，从而诱导分析目标从LDC释放。

在一些实施方案中，该方法进一步包括以下步骤：(a)测量从LDC释放的分析目标的量；和(b)使用释放的分析目标的量确定样品中药物分子或其部分的浓度。

在一些实施方案中，测量从LDC释放的分析目标的量的步骤包括使分析目标经受液相色谱-质谱法(LC-MS)。在一些实施方案中，测量从LDC释放的分析目标的量的步骤包括使分析目标经受液相色谱串联质谱法(LC-MS/MS)。

在一些实施方案中，该方法进一步包括以下步骤：(a)测量样品中配体的量；和(b)通过使用测得的配体的量确定样品中药物分子或其部分的浓度。