[发明专利]NIR荧光探针的固相合成

说明书

本发明公开了一种用于制备近红外(NIR)荧光探针的固相方法，其特征在于基于氮杂‑双环烷烃的环状肽被Cy5.5染料部分标记，并用于肿瘤和病理区域的导向手术。

发明领域

本发明涉及光学成像领域。更具体地，本发明涉及固相合成近红外(NIR)荧光探针(称为“DA364”)的方法，该探针包含以Cy5.5染料部分标记的基于氮杂-双环烷烃的环肽，并用于肿瘤和病理区域的引导手术。

发明背景

近红外荧光(NIRF)是用于对生理和病理状况进行成像以及在手术过程中进行可视化和指导的强大工具。实际上，NIR荧光具有穿透组织长达数厘米，减少散射并最大化外源NIR造影剂提供的背景信号对比度的优势。例如，它可用于定量体内肿瘤组织的成分，并从背景对比度变化中分辨出肿瘤。

由于这些原因，最近几年已经开发了几种包含NIR部分的诊断剂以对体内含靶标的组织成像。在广泛使用的近红外染料中，在约695nm处发射的荧光团Cy5.5已与某些靶向部分缀合，并被评估为可通过NIRF进行实时体内成像的荧光探针(例如参见Joshi B.P.等，Bioconjugate Chem.(生物缀合物化学)，2016，27，481-494)。

与生物标志物的缀合提供了更特异性的结合以及更好的摄取和保留。在适合与NIRF探针结合的靶向部分中，可以列举对特定靶标特异性的几种抗体或肽序列。广泛使用的生化工具是，例如，三肽RGD(Arg-Gly-Asp)，其可以被跨膜受体整联蛋白选择性地识别。

在光学成像领域中，本发明涉及与靶向整联蛋白过表达的肿瘤的拟肽缀合的荧光分子。更具体地说，本发明涉及一种改进的合成被称为DA364(参见下面的式I)的近红外(NIR)荧光探针的方法，该探针包含与Cy5.5染料部分缀合的基于氮杂-双环烷烃的环状肽RGD：

已经对DA364在术中成像中的应用进行了有效的研究。特别是，已经表明，上述式(I)化合物可以在NIR-荧光成像引导的肿瘤和病理区域治疗手术期间提供实时的肿瘤边缘检测和分界(例如，参见Conti L.等人，Contrast Media Mol.Imaging 2013，8，350-360；Lanzardo等人，Contrast Media Mol.Imaging 2011，6，449-458和WO2016/097317 A1(同一申请人)。

这种特定的化合物首先描述在Lanzardo等人的Contrast MediaMol.Imaging2011，6，449-458中，其中公开了其制备条件。如其中所述，DA364的合成涉及琥珀酰亚胺基酯Cy5.5-NHS与催化还原相应叠氮化物化合物后获得的环状拟肽(cRGD)氨基部分的反应。

叠氮化物中间体或其立体异构体的制备先前在同一申请人的专利申请WO2006/095234 A2和UniversitàdegliStudi Milano的WO2006/092722 A1中公开。特别地，WO2006/095234A2报道了一类新型的基于6,5-氮杂-双环烷烃的环肽，该环肽起着能够选择性结合整联蛋白受体的靶向部分的作用，并显示了制备与生物活性部分或成像可检测部分缀合的6,5-反式-氮杂-双环烷烃-cRGD化合物的方案(参见图3和5以及说明书的第41-48页)。

由氨基酸的非肽寡聚物部分制备的人工多肽描述在Muriel Amblard等人的US2003/191049 A1中。

官能化的氮杂-双环烷烃氨基酸的制备公开于Manzoni等人，J.Org.Chem.2005，70(10)，4124-4132中，而论文Manzoni等，Chem.Med.Chem.2009，4，615-632描述了含RGD的官能化氮杂-双环烷烃肽的制备，其从氮杂-双环烷烃骨架开始，通过溶液中的线性肽合成，然后环化RGD链。

上面引用的方法代表了溶液中目前用于制备DA364的程序，以下流程1和2对此进行了概述。