[发明专利]稳定且副作用少的基因组编辑用复合物和编码该复合物的核酸

说明书

本发明提供一种复合物，其为核酸序列识别模块与蛋白降解标签结合而得的复合物，所述核酸序列识别模块与双链DNA中的靶核苷酸序列特异性地结合，所述蛋白降解标签由(i)在C末端包含疏水性氨基酸的3个残基的肽或(ii)在C末端包含该氨基酸残基的至少一部分被丝氨酸取代的氨基酸的3个残基的肽构成。

技术领域

本发明涉及稳定且副作用少的基因组编辑用复合物和编码该复合物的核酸、以及使用了该复合物的基因组编辑方法。

背景技术

无需进行选择标记基因的整合、即可将对相同操纵子中的下游基因的表达的影响抑制在最小限度的这样的基因组编辑在原核生物中特别有利。源自噬菌体的RecET和λ-Red重组酶被用作重组技术，使依赖于供体DNA或寡核苷酸的同源性的整合/取代容易进行(例如非专利文献1)。通过与缺损了甲基定向性错配修复(MMR)的菌株组合，无需整合选择标记，即可实现高效率的重组(非专利文献2)，在几天内会产生多个靶基因座中的遗传多态性，因此在多重自动基因组工程学方法(MAGE)中应用。然而，上述重组技术依赖于MMR的缺损、或作为重组DNA修复系统的中心构成要素的RecA这样的宿主依赖性因子，会给作为用于克隆的宿主而使用的大部分大肠杆菌带来危害，因此无法容易地转用到背景不同的细菌种(非专利文献3)。

已知成簇的规律间隔短回文重复序列(clustered regularly interspacedshort palindromic repeats：CRISPR)和CRISPR相关(Cas)蛋白通过以依赖于单一向导RNA(sgRNA)和原间隔序列临近基序(PAM)的方式切割靶DNA而起到细菌的适应免疫系统的作用。源自酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)的Cas9核酸酶在具有DNA双链切割(DSB)的修复途径的真核生物中被广泛用作强效的基因组编辑工具(例如非专利文献4、5)。在通过非同源末端结合(NHEJ)途径进行的DSB修复中，向靶DNA中导入小的插入和/或缺失(indels：插入/缺失)，产生位点特异性突变或基因破坏。虽然效率依赖于宿主细胞，但为了更准确的编辑，通过提供包含针对靶区的同源臂的供体DNA，可促进同源重组修复(HDR)。

然而，由于目前的基因组编辑技术依赖于宿主的DNA修复系统，所以对于其在原核生物中的应用需要进一步研究。在大部分的细菌中，因缺乏NHEJ途径，通过利用人工核酸酶进行的DNA切割而发生细胞死亡(非专利文献6、7)。因此，CRISPR/Cas9仅被用作用通过λ-Red重组系统这样的其他方法用于基因已被修饰的细胞的反选择子(counter-selector)(例如非专利文献8、9)。

最近，由脱氨酶介导的靶碱基编辑得到证实，其通过靶基因座直接编辑核苷酸，而无需使用包含针对靶区的同源臂的供体DNA(例如专利文献1、非专利文献10～12)。该技术是利用DNA脱氨基化代替由核酸酶介导的DNA切割，因此不会诱导细菌的细胞死亡，可适用于细菌的基因组编辑，但其突变效率、特别是同时对多处进行编辑的效率还谈不上充分。

现有技术文献

专利文献专利文献1：国际公开第2015/133554号；

非专利文献

非专利文献1：Datsenko,K.A.Wanner,B.L.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.97,6640-5(2000)；

非专利文献2：Costantino,N.Court,D.L.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.100,15748-53(2003)；

非专利文献3：Wang,J.等人,Mol.Biotechnol.32,43-53(2006)；

非专利文献4：Mali,P等人,Science 339,823-827(2013)；

非专利文献5：Cong,L等人,Science 339,819-823(2013)；