[发明专利]使用脂质纳米粒子的体外MRNA递送方法

说明书

本公开涉及用于将mRNA引入干细胞诸如HSPC以及用于将基因编辑组分体外递送至此类细胞的组合物和方法。举例而言，本公开涉及在HSPC中使用CRISPR‑Cas9复合物修饰基因序列，以及用于在HSPC中实现这种基因修饰的方法和递送系统。

本申请要求2017年9月29日提交的美国临时专利申请号62/566,232的优先权，所述申请的内容以引用方式整体并入本文。

将遗传变化引入干细胞(包括造血干细胞(HSC))及其后代中，对于基因编辑和基因治疗方法具有重要意义。干细胞(诸如HSC)在成熟细胞和定向祖细胞中失去增殖能力，使得它们对于基因编辑技术特别有用。举例而言，体外修饰HSC和干细胞的能力很重要，并且需要将生物剂递送至培养物中的HSC和其他干细胞的方法。特别需要用于递送培养物中的人类HSC的技术。

HSC对于终身造血是必不可少的。HSC由于能够分化而产生所有髓系和淋巴系血液谱系的成熟后代或者能够自我更新而替代逐渐定向于分化的细胞，因此能够维持长期的功能性造血作用。HSC可用于恢复移植受者、免疫受损患者或其他患者体内的血液和免疫细胞。具体地，HSC的自体或同种异体移植可用于治疗患有遗传性免疫缺陷和自身免疫疾病以及多种造血病症的患者，以重建造血细胞谱系和免疫系统防御。

将CRISPR/Cas基因编辑系统的组分递送至培养物中的HSC的方法是特别受关注的。本文提供将RNA(包括CRISPR/Cas系统组分)递送至包括HSC的造血细胞培养物的方法。所述方法将活性蛋白递送至体外培养的干细胞(包括HSC)，并且包括使所述细胞与提供编码所述蛋白质的mRNA的脂质纳米粒子(LNP)组合物接触。另外，提供在干细胞诸如HSC中进行体外基因编辑的方法，以及产生工程化细胞的方法。

在一些实施方案中，提供在HSC中进行体外基因编辑的方法，以及产生工程化HSC细胞的方法。在另外的实施方案中，本文提供一种将mRNA递送至造血干细胞和/或祖细胞(HSPC)或HSPC群体的方法。在一些实施方案中，所述方法包括将血清因子与包含mRNA、胺脂质、辅助脂质、中性脂质和PEG脂质的LNP组合物一起预孵育。在一些实施方案中，所述方法还包括在体外使HSPC或HSPC群体与预孵育的LNP组合物接触。在一些实施方案中，所述方法还包括在体外培养HSPC或HSPC群体。在一些实施方案中，所述方法导致将mRNA递送至HSPC或HSPC群体。

在一些实施方案中，本文提供一种将Cas核酸酶mRNA和gRNA引入干细胞例如HSPC的方法。在一些实施方案中，所述方法包括将血清因子与包含Cas核酸酶mRNA、gRNA、胺脂质、辅助脂质、中性脂质和PEG脂质的LNP组合物一起预孵育。在一些实施方案中，所述方法还包括在体外使HSPC与预孵育的LNP组合物接触。在一些实施方案中，所述方法还包括培养HSPC。在一些实施方案中，所述方法导致将Cas核酸酶mRNA和gRNA引入HSPC。

在一些实施方案中，本文提供一种在体外产生基因工程化干细胞例如HSPC的方法。在一些实施方案中，所述方法包括将血清因子与包含Cas核酸酶mRNA、gRNA、胺脂质、辅助脂质、中性脂质和PEG脂质的LNP组合物一起预孵育。在一些实施方案中，所述方法还包括在体外使HSPC与预孵育的LNP组合物接触。在一些实施方案中，所述方法还包括在体外培养HSPC。在一些实施方案中，所述方法导致产生基因工程化的HSPC。

在一些实施方案中，提供一种将mRNA递送至HSPC或HSPC群体的方法，所述方法包括将LNP组合物与血清因子一起预孵育，在体外使细胞或群体与预孵育的LNP组合物接触；以及在体外培养细胞或群体；从而将mRNA递送至HSPC。在一些实施方案中，HSPC为HSC。在一些实施方案中，所述方法将mRNA诸如Cas核酸酶mRNA递送至HSPC群体(例如CD34+细胞群体)。在某些实施方案中，将指导RNA(gRNA)任选地与Cas核酸酶mRNA组合递送至细胞。

附图说明

图1显示使用LNP在CD34+骨髓细胞中进行的绿色荧光蛋白(GFP)mRNA递送。