[发明专利]乙型肝炎病毒s抗原的测定方法和测定试剂盒

说明书

本发明公开了一种高灵敏度的HBsAg的测定方法和测定试剂盒，其中，在样本预处理中，不进行强酸或碱处理，且不易受到自身抗体的影响。这种从生物体分离的样本中的乙型肝炎病毒s抗原的测定方法包括：预处理工序，其中，将样本与包含还原剂的预处理试剂混和而将乙型肝炎病毒s抗原还原；和免疫测定工序，其中，使用抗体或其抗原结合性片段中的至少一种，对预处理后的样本进行乙型肝炎病毒s抗原的免疫测定，所述抗体能够与包含乙型肝炎病毒s抗原的第98‑179位氨基酸的被还原的肽发生抗原抗体反应。

技术领域

本发明涉及乙型肝炎病毒s抗原的测定方法和测定试剂盒。

背景技术

乙型肝炎目前是肝疾病中最多的疾病，是因乙型肝炎病毒(HBV)感染人而引起的病毒性肝炎。

该乙型肝炎病毒的本体是直径42nm的呈双层结构的球形颗粒的形状的、被称为“大球形(Dane)颗粒”的颗粒。已知大球形颗粒的表面由被称为乙型肝炎病毒s抗原(HBsAg)的表面抗原覆盖，此外在内部存在直径27nm的核心结构，上述核心结构包含HBc抗原(核心抗原)、HBe抗原、以及编码病毒基因的环状双链DNA。

HBsAg是具有感染性的HBV颗粒表面的肿瘤构成外壳蛋白，其包含在包裹着含有HBV-DNA的核心颗粒的来自肝细胞的脂质双层膜中。另外，HBV感染者的血液中，也存在没有核心颗粒的、包含HBsAg的不具有感染性的小球形颗粒、管型颗粒。小球形颗粒最多量地存在于血中，以相对于1个～几个HBV颗粒为约1000个的比率被观察到。目前市售的HBsAg检查主要是检测上述小球形颗粒形态的HBsAg。

HbsAg是由全长226个氨基酸残基构成的、4次贯穿脂质双层膜的膜蛋白(将其氨基酸序列示于序列号1)。虽然尚未完全明晰HBsAg的跨膜结构模型，但是例如非专利文献1中公开了一种跨膜模型之一(图1)。根据该跨膜模型，HBsAg中存在4个跨膜区，HBsAg的第8～23位的氨基酸残基为第1跨膜区，第80～98位的氨基酸残基构成第2跨膜区。除此以外，HBsAg中存在由第23～80位的氨基酸残基构成的脂质双层的第1内侧区域，由第98～179位的氨基酸残基构成的亲水性的第2外侧(内质网腔(ER lumen))区域，以及第179位以后的疏水性的第3跨膜区、第2内侧区域、第4跨膜区。

作为以往的HBsAg的分析方法，使用与HBsAg的共同抗原决定簇a结合的抗体的方法是常见的。共同抗原决定簇a位于HBsAg的第2外侧(内质网腔)区域、即局部存在于病毒颗粒表面的由第98～179位的氨基酸残基中的第110～156位的氨基酸残基构成的肽上。已经报道了该共同抗原决定簇a由复杂的高级结构构成，在其上存在至少4个表位(非专利文献2)。

HBV的急性感染患者中，在感染初期HBsAg为阳性，但是其后HBs抗体变为阳性，HBsAg变为阴性。在患者的血液中的HBs抗体为阳性的情况下，在上述的使用与共同抗原决定簇a结合的抗体的方法中当对HbsAg进行分析时，分析方法中使用的抗体与HBsAg的结合受到患者的HBs抗体的阻碍，测定值变低。对此，可采取利用酸化剂或碱化剂对样本进行预处理，避免来自患者的HBs抗体(自身抗体)因形成其与HBsAg的免疫复合体而造成的影响的方法；或者利用表面活性剂等对样本进行预处理而使存在于HBV颗粒的内侧的抗原(内侧抗原：自身抗体不易结合)露出，使用与内侧抗原特异性结合的抗体进行检测的方法(专利文献1、2)。

在HBs抗体价高的患者中，即使使HBs抗体(自身抗体)从免疫复合体解离，也仍然存在游离的自身抗体与免疫测定中使用的抗体之间发生竞争反应的可能性。因此，已知在样本的预处理工序中，通过较强酸处理或碱处理(例如小于pH3.0或超过pH12.0)使游离的自身抗体进一步灭活的方法(例如，专利文献3)。

现有技术文献

专利文献

专利文献1:日本专利第4430677号

专利文献2:EP 2088431 A1