[发明专利]真皮乳头和毛囊等同物的体外制备方法

权利要求书

1.一种用于体外制备真皮乳头等同物的方法，该方法包括以下中的至少一个步骤：在包含无血清营养培养基B的支持物上培养成纤维细胞，持续足以使所述成纤维细胞从所述支持物脱离并聚在一起形成至少一个球状体的时间段，这些成纤维细胞源自真皮乳头和/或源自结缔组织鞘；使用的所述支持物的表面不允许细胞粘附；所述培养支持物选自2D或3D圆底微孔板培养支持物。

2.如权利要求1所述的方法，其中以至少14000个细胞/cm²的密度，优选地以在14000个细胞/cm²与47600个细胞/cm²之间的密度，甚至更好以在23500个细胞/cm²与24500个细胞/cm²之间的密度，将所述成纤维细胞接种在所述2D培养支持物上。

3.如权利要求1所述的方法，其中以至少3000个细胞/cm²的密度，优选地至少9000个细胞/cm²的密度，甚至更好以在9000个细胞/cm²与20000个细胞/cm²之间的密度，将所述成纤维细胞接种在所述3D培养支持物上。

4.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述营养培养基B包含500至1500mg/l的氨基酸、2至18mg/l的维生素、1500至4500mg/l的葡萄糖、8750至10000mg/l的无机盐、2至20μg/ml的胰岛素、2至60ng/ml的氢化可的松、以及任选地50至200μg/ml的抗生素和/或抗真菌剂。

5.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中将所述成纤维细胞培养至少3天，优选地至少4天，甚至更好4天与21天之间。

6.如权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述支持物的表面是中性的和疏水性的。

7.如权利要求1至6中任一项所述的方法，该方法在培养所述成纤维细胞的步骤之前还包括以下预备步骤：

a.从头皮样品中分离出生长期毛囊；

b.通过该真皮乳头和/或该结缔组织鞘的显微解剖来回收该真皮乳头和/或该结缔组织鞘的成纤维细胞；

c.在由DMEM Glutamax构成的，补充了20％体积的胎牛血清(FCS)、50至90mg/l的非必需氨基酸和任选地50至200μg/ml的抗生素和/或抗真菌剂的营养培养基A中，进行所述真皮乳头成纤维细胞和/或所述结缔组织鞘成纤维细胞的扩增。

8.一种体外真皮乳头等同物，其可通过如权利要求1至7中任一项所述的方法获得。

9.如权利要求8所述的体外真皮乳头等同物，其特征在于它具有阳性碱性磷酸酶活性。

10.增殖性上皮细胞和如权利要求8和9中任一项所述的体外真皮乳头等同物用于制备体外毛囊等同物的用途。

11.一种用于体外制备毛囊等同物的方法，该方法包括以下中的至少一个步骤：在至少一种如权利要求8或9中所定义的真皮乳头等同物的存在下培养增殖性上皮细胞，持续足以使所述增殖性上皮细胞分化为对标志物K85和K35呈阳性的角质形成细胞的时间段。

12.如权利要求11所述的方法，其中以至少2000个细胞/cm²的密度，优选地至少6000个细胞/cm²的密度，并且甚至更好在6000个细胞/cm²与10000个细胞/cm²之间的密度，将这些增殖性上皮细胞进行接种。

13.如权利要求11或12中所述的方法，其中将这些增殖性上皮细胞培养至少3天，优选地至少5天，甚至更好5天与20天之间。