[发明专利]用于抗微生物剂敏感性测试和细菌菌种确认的基于噬菌体的检测方法

说明书

本发明提供了确定细菌身份和对抗生素或抗微生物剂的敏感性或耐受性的方法。在一个实施方式中，在存在或不存在抗生素剂的情况下培养细菌以产生多种原代培养物，然后在存在或不存在转化噬菌体的情况下将其培养以产生第一继代培养物和第二继代培养物，该第一继代培养物包含已经用抗生素剂处理过的转化细菌，而第二继代培养物包含未用抗生素剂处理过的转化细菌。重组噬菌体对细菌具有特异性，并包含异源标记。细菌对抗生素或抗微生物剂的敏感性或耐受性通过比较第一继代培养物和第二继代培养物中标记的水平或活性来确定。

相关申请的交叉引用

本申请要求享有2017年10月2日提交的美国临时申请号62/566,864的权益，其内容在此通过引用全文并入。

技术领域

本文描述的主题涉及用于确认细菌病原体并界定细菌对测试剂的敏感性的方法，以及用于确定目标细菌菌种是否对一种或多种抗微生物剂具有抗性的方法。进一步的实施方式涉及筛选新的测试化合物的抗微生物或益生菌活性的方法，包括检测生物样品(包括临床样品、食品和环境样品)中此类试剂的存在。

背景技术

自从抗生素青霉素首次实际应用以来，已经开发了许多其他抗菌剂，并且抗菌疗法极大地促进了现代医学的发展和平均寿命的延长。然而，致病菌已经获得了对大多数抗菌剂的抗性，从而损害了抗菌疗法的整体有效性，同时也带来了新的公共卫生问题。特别地，显示出对β-内酰胺抗菌剂具有抗性的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)是高度抗性的病原体。它与每年将近94,000例新住院直接相关，仅在美国每年就导致大约19,000人死亡(Voss等人，International Journal of Antimicrobial Agents，5：101-106，1995；McGeer等人，LPTP Newsletter，190：1-4，1996；CDC MRSA追踪)。部分原因是畜牧业和医院中抗生素的使用增加，新的耐多种药的细菌菌株也以惊人的速度出现。例如，有报告称在接受万古霉素治疗的MRSA感染患者中出现了万古霉素中间金黄色葡萄球菌(VISA)感染(Hiramatsu等人，J Antimicrob Chemother，40(1)，135-6，1997；Perichon等人，Antimicrob AgentsChemother.，53(11)：4580-7，2009)。实际上，一些菌株已对几乎所有常用抗菌剂产生抗性。一个声名狼藉的例子是MRSA的Mu50菌株，它也对氨基糖苷类、大环内酯类、四环素、氯霉素和林可酰胺类耐药(Hiramatsu等人，同上)。还已经确认了对异烟肼和利福平具有耐受性的耐多种药物的结核分枝杆菌(Dalton等人，Lancet，380：1406-17，2012)。

食源性细菌疾病，特别是由抗药性细菌引发的疾病，也对人类健康构成重大威胁。一项微生物学研究分析了包括蔬菜沙拉、生鸡蛋表面、生鸡肉、未巴氏灭菌的牛奶和生肉在内的150份食物样品中的大肠杆菌，发现在生鸡肉中检出的抗药性大肠杆菌分离物的百分比最高(23.3％)，其次是蔬菜沙拉(20％)、生肉(13.3％)、生鸡蛋表面(10％)和未经巴氏灭菌的牛奶(6.7％)。抗药性大肠杆菌的总发病率为14.7％(Rasheed等人，Rev Inst MedTrop Sao Paulo，56(4)：341-346，2014)。这项研究进一步强调了抗药性大肠杆菌将抗药基因转移到其他物种(如克雷伯氏菌属)的能力带来的威胁。

越来越多的科学证据指出细菌如何进化防御系统，以防御目前使用的五类主要抗菌药物。这些药物大致分为β-内酰胺类、β-内酰胺酶抑制剂、头孢菌素类、喹诺酮类、氨基糖苷类、四环素/甘氨酰环素和多粘菌素。下文概述了每种试剂的局限性，尤其是在以单个使用时。