[发明专利]DNA聚合酶

说明书

本发明提供一种DNA聚合酶，其包括SEQ ID NO.1的序列或与所述SEQ ID NO.1的序列具有至少70％同一性的序列，但是其中所述SEQ ID NO.1的第18位处的天冬氨酸残基或其它序列中的等同的天冬氨酸残基已被非负电荷的氨基酸残基置换。本发明进一步提供包含SEQ ID NO.2、11和12的氨基酸序列及其变体的DNA聚合酶。本发明还提供编码所述DNA聚合酶的核酸，生产所述DNA聚合酶的方法，以及包含所述DNA聚合酶的组合物、表达载体和宿主细胞或病毒。本发明还提供所述DNA聚合酶在核苷酸聚合、扩增和测序反应中的用途。

本发明涉及DNA聚合酶。特别地，本发明涉及具有增强的链置换活性(SDA)的经修饰DNA聚合酶。

微生物鉴定的黄金标准仍然是致病原的培养和随后的表型分化，这个过程通常需要花费几天的时间进行并分析，这种延迟可能会对传染病的发病率和死亡率产生重大影响。另外，多种生物不能在培养基上生长，因此，将无法通过现有的培养方法进行检测。

全球范围内的需求是监测和诊断诸如HIV/AIDS、肺结核、疟疾、霍乱等重大传染病。在诸如埃博拉病毒、禽流感和猪流感爆发的潜在流行情况下，挑战变得更加严峻。尽管诊断技术取得了进步，但许多疑似感染的患者仍在接受经验性的抗菌疗法，而不是由迅速鉴定出传染原所决定的适当治疗。结果是过度使用了我们库存少的有效抗菌剂，由于抗菌剂耐药性的发展，有效抗菌剂的数量持续减少。明确需要使得能够鉴定特定病原体的新型快速原位分子诊断测试。

聚合酶链反应(PCR)在多个方面革新了分子遗传学和诊断领域。PCR技术中的主力军是热稳定的高保真DNA聚合酶，其与加热和冷却以获得链分离、引物退火和延伸的循环事件一起，导致目标DNA序列的扩增。PCR技术现已广泛应用于生物医学和生命科学研究以及分子诊断中。

即时护理(POC)诊断被描述为能够在医院环境外的患者社区中进行疾病诊断的医疗工具或装置。理想的诊断测试应符合“ASSURED”标准：价格实惠(Affordable)、灵敏(Sensitive)、特异(Specific)、用户友好(User-friendly)、快速(Rapid)而稳健、无需设备(Equipment-free)且交付(Delivered)给需要的人。POC方法优选是简单的，并且不需要热源或稳定的电源，因为这些通常在POC中是不可用的。因此，所使用的酶和试剂应在环境温度下使用。

尽管PCR技术具有高潜力，但它仍然具有严格的局限性，并且需要使用高精度电动热循环设备以进行重复的加热和冷却过程，并需要技术熟练的人员来运行所述设备。由于退火过程中的虚假引发而导致的非特异性扩增是有问题的，PCR也易于受“粗”样品中的抑制性化合物的影响。此外，PCR装置的庞大设计使得PCR成为并入POC技术平台的有缺陷的解决方案，并使得基于PCR的方法难以用作POC诊断的主要技术推动者。