[发明专利]用于制备来源于MSC的外泌体的方法

说明书

本发明提供了制备临床级别的来源于间充质干细胞(MSC)的外泌体的方法。还提供了用治疗剂诸如siRNA装载外泌体的方法。本发明还提供了通过施用所述临床级别的外泌体治疗疾病的方法。

本申请要求于2017年11月16日提交的美国临时专利申请No.62/587,408的权益，该临时专利申请通过引用完整地结合于此。

背景技术

1.技术领域

本发明一般地涉及分子生物学和医学领域。更具体地，它涉及用于大规模产生符合良好生产规范-(GMP)的外泌体的方法。

2.相关领域描述

胞外囊泡(EV)，包括外泌体(exosome)和微泡，是纳米尺寸的细胞间通讯媒介，其参与数个生理过程。具体地，外泌体是由细胞释放的纳米尺寸的囊泡并且它们构成细胞组分和产物的细胞间交换的一种方式，其已经刺激了将它们用作治疗剂递送剂的更新的兴趣。与它们的人工对应物不同，这些天然生成的专门化的细胞间穿梭服务的特征可以为有效递送治疗剂有效负载提供独特的优势。外泌体的这些特征和与外泌体产生和细胞摄取相关的调节机构仍然有待进一步研究。然而，使用外泌体用于治疗性控制疾病(包括癌症)已经显示了有前景的结果。

由于它们的生物学性质，外泌体是有希望的候选物，用于治疗免疫病症和用于系统递送治疗剂化合物，诸如细胞因子、化疗药物、核酸和病毒载体。然而，它们的低产生收率限制了它们在临床中的应用潜力。因此，存在对于产生可以用于治疗剂的外泌体的有效方法的未满足的需求。

发明内容

在第一实施方案中，提供了从间充质干细胞(MSC)制备外泌体的方法，包括：在功能封闭的生物反应器中在包含人血小板裂解物(PLT)的培养基中培养MSC至汇合(例如，75-95％或80-90％汇合,诸如约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％或90％)；在基本上不含PLT(例如，不含PLT)的培养基中进一步培养细胞；从生物反应器中收集条件培养基级分；和从所述条件培养基级分中分离外泌体。

在一些方面，每个条件培养基级分在收集后被保存在-80℃。在某些方面，将条件培养基级分解冻并且合并，之后分离。

在某些方面，MSC进一步限定为骨髓来源的MSC。在特定方面，MSC进一步限定为脂肪来源的MSC。

在另外的方面，所述方法进一步包括用至少1x10⁷个MSC接种生物反应器，之后在生物反应器中培养MSC。在一些方面，将MSC以约400-500个细胞/cm²的密度接种。

在某些方面，封闭的生物反应器是中空纤维生物反应器。在一些方面，中空纤维生物反应器是Terumo细胞扩增系统。

在一些方面，在MSC培养物的培养基中PLT的浓度为5％。PLT的浓度可以是约2-10％，诸如3、4、5或6％。在某些方面，将新鲜培养基连续添加到生物反应器中的MSC。在具体方面，将细胞在5％氧下培养。在某些方面，步骤(a)的培养持续5-10天，诸如6、7、8或9天。在具体方面，步骤(a)的培养持续8天。

在某些方面，将MSC培养至85-90％汇合，诸如85、86、87、88、89或90％汇合。汇合可以通过监视葡萄糖和乳糖水平来测量。例如，乳糖水平可以是约2-6mmol/L,诸如约2、3、4、5或6mmol/L，并且葡萄糖水平可以是约80-140mg/dL,诸如约80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135或140mg/dL。

在一些方面，在基本上不含PLT的培养基中培养24-72小时，诸如24-48、36-50、48-60或50-72小时,诸如约36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51或52小时。在具体方面，在基本上不含PLT的培养基中培养约48小时。在具体方面，进一步培养步骤的培养基不含PLT。