[发明专利]灵长类动物视网膜色素上皮细胞特异性启动子SynP61

说明书

本发明涉及一种在灵长类动物的视网膜色素上皮细胞中特异性表达外源基因的方法，所述方法包括将分离的核酸分子递送至所述灵长类动物的视网膜色素上皮细胞的步骤，所述分离的核酸分子包含SEQ ID NO:1的核酸序列或由其组成，或者由与SEQ ID NO:1的序列具有至少80％总体同一性的至少1500bp的核酸序列组成，其中，当编码外源基因的核酸序列与所述分离的核酸分子可操作地连接时，所述分离的核酸分子使得所述外源基因在灵长类动物的视网膜色素上皮细胞中特异性表达。

技术领域

本发明涉及一种核酸序列，该核酸序列使得基因在视网膜色素上皮(RPE)细胞中特异性表达。

背景技术

出于表达目的，通常将重组基因在活性表达盒的背景下作为cDNA构建体转染到靶细胞、细胞群或组织中，以允许异源基因转录。DNA构建体在涉及顺式调控元件上的许多反式作用转录因子(TF)的活性的过程中被细胞转录机器识别，这些顺式调控元件包括增强子、沉默子、绝缘子和启动子(本文统称为“启动子”)。

基因启动子参与所有这些层面的调控，通过整合DNA序列、转录因子结合特征和表观遗传特征的影响，充当基因转录中的决定因素。它们决定例如由质粒载体编码的转基因表达的强度，以及将在其中表达所述转基因的一种或多种细胞类型。

用于驱动哺乳动物细胞中的异源基因表达的最常见启动子是人和小鼠巨细胞病毒(CMV)主要立即早期启动子。它们赋予强烈的表达，并且已在若干细胞类型中证明了稳健性。其他病毒启动子如SV40立即早期启动子和劳氏肉瘤病毒(RSV)长末端重复序列(LTR)启动子也经常用在表达盒中。

也可以使用细胞启动子代替病毒启动子。已知的启动子有来自管家基因的那些启动子，这些管家基因编码大量转录的细胞转录物，如β-肌动蛋白、延伸因子1-α(EF-1α)或泛素。与病毒启动子相比，真核基因表达更复杂并且需要许多不同因子的精确协调。

关于内源性调控元件用于转基因表达的用途的一个方面是产生稳定的mRNA，并且该表达可以在宿主细胞的天然环境中进行，其中相应地提供反式作用转录因子。由于真核基因的表达受顺式和反式作用调控元件的复杂机制控制，因此大多数细胞启动子未得到广泛的功能表征。部分真核启动子通常紧邻其转录序列的上游，并且充当转录起始点。核心启动子直接围绕转录起始位点(TSS)，该位点足以被转录机器识别。近端启动子包含核心启动子上游的区域，并且含有TSS和转录调控所需的其他序列特征。转录因子通过与启动子和增强子序列中的调控基序结合而序列特异性地起作用，从而激活染色质和组蛋白修饰酶，这些酶改变核小体结构及其位置，最终允许转录起始。功能性启动子的鉴定主要取决于相关上游或下游增强子元件的存在。

关于内源性调控元件用于转基因表达的用途的另一关键方面是一些启动子可以按细胞特异性方式起作用并且将使得转基因在特定类型的细胞上/中表达，或取决于启动子，在特定亚群的细胞中表达。

因此，本发明的一个目的是获得适用于在哺乳动物的视网膜细胞中以高表达水平并以细胞类型特异性方式表达重组基因的新序列。

此类序列满足了本领域对视网膜细胞特异性启动子的需求，以开发用于研究神经退行性障碍、视力恢复、药物发现、肿瘤疗法和障碍诊断的系统。

发明内容

目前，本发明的诸位发明人已偶然发现已知在WO 2015/121793中所述的鼠模型中在米勒细胞(Müller cell)中特异性驱动基因表达的启动子，其在灵长类动物中具有非预期且非典型的完全不同的特异性。在灵长类动物中，该启动子特异性驱动视网膜色素上皮(RPE)细胞中的基因表达。这种特异性对于解决和靶向在例如年龄相关性黄斑变性、视网膜色素变性、糖尿病性视网膜病变或视网膜色素上皮增生患者的病变视网膜的视网膜色素上皮细胞中的基因表达十分有用。