[发明专利]用于扩增双链DNA的方法和试剂盒在审
| 申请号： | 201880087158.3 | 申请日： | 2018-11-14 |
| 公开（公告）号： | CN111712580A | 公开（公告）日： | 2020-09-25 |
| 发明（设计）人： | 安赫尔·杰奎因·皮切尔·塞兰蒂斯;贝蒂娜·布迪乌斯 | 申请（专利权）人： | 4贝思生物有限公司 |
| 主分类号： | C12Q1/6855 | 分类号： | C12Q1/6855 |
| 代理公司： | 北京安信方达知识产权代理有限公司 11262 | 代理人： | 王玮玮;郑霞 |
| 地址： | 西班牙*** | 国省代码： | 暂无信息 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 用于 扩增 dna 方法 试剂盒 | ||
1.一种扩增DNA的方法，所述方法包括：
a)提供线性双链DNA分子；
b)将单链衔接子附接至所述线性双链DNA分子的两端以产生单链共价闭合的DNA分子；以及
c)通过(i)滚环扩增和(ii)多重置换扩增，以单次操作扩增所述单链共价闭合的DNA分子。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述线性双链DNA分子包括凋亡无细胞DNA分子，所述凋亡无细胞DNA分子例如，具有小于480bp、小于320bp或在约140bp和180bp之间(例如，平均约160bp)的尺寸。
3.如权利要求1所述的方法，其中提供所述线性双链DNA包括将染色体DNA片段化。
4.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述线性双链DNA源自来自哺乳动物的一种或更多种体液，所述一种或更多种体液例如选自CSF、血液、血浆、血清、腹水、尿液、唾液、泪滴、乳汁、精液和滑液。
5.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中提供所述线性双链DNA包括从生物样品的其他细胞组分中分离所述线性双链DNA。
6.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中提供所述线性双链DNA包括末端修复和/或dA加尾。
7.如权利要求5所述的方法，其中末端修复使用T4多核苷酸激酶(PNK)、T4 DNA聚合酶、克列诺片段和T4 DNA聚合酶大片段中的一种或更多种来进行。
8.如权利要求5所述的方法，所述方法包括使用Taq聚合酶进行dA加尾。
9.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述衔接子包含单链DNA分子。
10.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述衔接子具有发夹结构。
11.如前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法包括附接具有以下序列的衔接子：5'TAACATTTGTTGGCCACTCAGGCCAACAAATGTTAT3'[SEQ ID NO:1]。
12.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述衔接子包含引发酶/聚合酶识别序列。
13.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中附接衔接子包含平末端连接或粘性末端连接。
14.如前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法包括：
提供凋亡无细胞DNA分子；
对所述无细胞DNA分子进行末端修复和dA加尾；以及
将包含dT突出端的发夹衔接子连接至末端修复的dA加尾的无细胞DNA分子。
15.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中扩增通过引发酶/聚合酶来引发。
16.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中扩增通过嗜热栖热菌(Thermusthermophilus)引发酶/聚合酶(TthPrimPol)来引发。
17.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中扩增通过具有序列SEQ ID NO:10的TthPrimPol来引发。
18.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中扩增通过人类引发酶/聚合酶(HsPrimPol)来引发。
19.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中扩增用随机合成的引物(例如，随机六聚体序列)来引发。
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