[发明专利]用于扩增双链DNA的方法和试剂盒

说明书

本文公开了用于扩增双链DNA分子的装置和方法。用于扩增凋亡无细胞DNA(apoptotic cell‑free DNA)分子的方法可以包括对cfDNA分子进行末端修复和dA加尾，将单链发夹衔接子附接至末端修复的cfDNA分子的两端以产生加衔接子标签的单链共价闭合的DNA分子，以及通过使用具有链置换活性的DNA聚合酶，PrimPol酶和游离核苷酸的滚环扩增和多重置换扩增的组合来扩增加衔接子标签的单链共价闭合的DNA分子。

关于联邦资助的研究的声明

无。

相关申请的引用

本申请与2017年11月21日提交的美国临时申请62/589,074有关。

联合研究协议的各方名称

无。

序列表

本文随附。

背景

过去10年见证了癌症疾病理解以及靶向疗法开发方面的巨大进步。在过去的10年里，FDA和EMA批准了数量空前的新药用于癌症治疗¹。最著名的药物中的一些包括靶向EGFR(HER2)受体的用于治疗乳腺癌的曲妥珠单抗(赫赛汀)、靶向EGFR(HER1)受体的用于治疗结肠直肠腺癌的西妥昔单抗(爱必妥)、靶向Bcr-Abl融合蛋白的用于骨髓增生性紊乱和CML的伊马替尼(格列卫)、靶向若干种酪氨酸蛋白激酶的用于肝癌和肾癌的索拉非尼(多吉美(Nexavar))、经由抑制ALK-EML融合蛋白用于治疗非小细胞肺癌的克唑替尼(赛可瑞(Xalkori))或经由抑制Braf V600E突变激酶用于治疗黑素瘤的维罗非尼(Vemurafenib)(泽波拉夫(Zelboraf))。大量靶向疗法的可用性产生了对患者进行有效分子分析(profiling)的需求。

“液体活组织检查”是为了描述对患者的血液或其他体液(例如尿液或脑脊液(CSF))中的核酸进行的诊断程序而创造的术语^2,3,4。在多种疾病(癌症、心肌梗死、移植排斥)中通过凋亡或坏死而死亡的细胞从其片段化的基因组释放DNA到血流中。此外，可以在母亲的血液中检测到来自胎儿的DNA。一种特殊情况是外来体，其为30-100nm的微囊泡，其紧挨着DNA或RNA，还含有来自来源细胞(originating cell)的蛋白和脂质^5,6,7。血液中的这些核酸可以使用基于PCR的方法、下一代测序(NGS)或阵列技术来检测和分析。通过分析液体活组织检查(例如，从体液而不是从肿瘤团块获得的核酸)产生的数据显示了该方法的巨大潜力，该方法对医学诊断可能具有革命性的影响，可能与之相似的只有引入磁共振成像(MRI)的影响。对于液体活组织检查方法，看起来特别有希望的临床应用是通过分析来自母亲的血液来诊断胎儿的染色体异常(特别是三体性)(也被称为基于cfDNA的非侵入性产前筛查(NIPT))^{8,9,10,11,12,13,14,15}，诊断和监测移植患者的移植物排斥(可以在患者的血液中检测到来自受宿主免疫细胞攻击的供体组织的DNA)^{16,17,18,19,20}，以及诊断和监测癌症疾病^{2,4,21,22,23,24,25}。迄今为止数据有限的领域是伴随组织坏死或凋亡的其他疾病，诸如心肌梗死²⁶。“液体活组织检查”的使用在检测胎儿染色体异常(特别是三体性)方面是最领先的，其中基因组诊断正在挑战通过超声测量颈后透明层厚度和三联筛查(AFP、hCG和雌三醇)的常规组合¹¹。然而，具有最高医学影响的有前景的领域显然是肿瘤学，其中在过去几年期间产生的数据显示，关键的癌症突变(反映常规肿瘤活组织检查中存在的那些)原则上可以通过液体活组织检查来检测^3,27,28。