[发明专利]用于在蛋白A色谱法期间增强杂质去除的方法

说明书

本文提供涉及经由蛋白A色谱法纯化包含Fc区的多肽(例如，抗体)的方法；涉及在蛋白A色谱法期间使用包含苯甲酸盐和/或苯甲醇的洗涤溶液的方法；以及在蛋白A色谱法之前使用苯甲酸钠调节收获物的方法。

相关申请的交叉引用

本申请要求2017年12月21日提交的美国临时申请系列号62/609,214和2018年7月5日提交的美国临时申请系列号62/694,387的优先权权益，所述专利申请的内容通过提述以其整体并入本文。

发明领域

本公开涉及经由蛋白A色谱法纯化包含Fc区的多肽(例如，抗体)的方法。

背景

已经发现抗体和其它含有Fc区的蛋白质(如免疫粘附素)广泛用于药物/治疗应用中。这些分子的使用(例如，在人类患者中)需要仔细纯化以除去在蛋白质生产期间可产生的任何污染物/杂质。治疗性蛋白质的纯化常常是利用一个或多个色谱纯化步骤来实现的；含有免疫球蛋白Fc区的蛋白质(例如抗体)的色谱纯化中的一种特别有用的类型是蛋白A色谱法。然而，已显示宿主细胞蛋白(HCP)在常规捕获模式蛋白色谱(包括蛋白A色谱法)期间与抗体共洗脱，这对于这些抗体的下游应用可产生问题。通常，在洗脱之前，产物(例如，含有免疫球蛋白Fc区的蛋白质)与色谱树脂结合后，采用一个或多个洗涤步骤。不幸的是，由盐和缓冲物质组成的当前洗涤配制物可不足以破坏HCP和其它杂质与多种单克隆抗体(mAb)产物的相互作用。因此，需要改进的纯化方法(例如，实施新的洗涤配制物)，该方法减少与抗体共纯化(例如，在蛋白A亲和色谱法期间)的杂质(例如，HCP)的浓度/数目。

本文引用的所有参考文献，包括专利申请、专利出版物、非专利文献和UniProtKB/Swiss-Prot登录号均通过提述以其整体并入本文，如同每篇单独的参考文献均被具体而单独地指示以通过提述而被并入。

发明概述

为了满足上述和其它需求，本文公开了从一种或多种杂质中纯化含有Fc区的多肽的改进方法。这些方法包括使蛋白A色谱基质与包含(i)包含Fc区的多肽和(ii)一种或多种杂质的样品(例如，细胞裂解物)接触，并用pH为约4.0-10.0且包含苯甲酸盐和/或苯甲醇的洗涤溶液洗涤该基质。本公开至少部分基于以下令人惊讶的发现：在蛋白A色谱法期间在pH为约4.0-10.0的洗涤溶液中使用苯甲酸盐(例如苯甲酸钠)和/或苯甲醇提供超过当前所利用的洗涤配制物的优异的杂质(例如宿主细胞杂质)清除(参见图1、实施例1)。本公开还至少部分地基于以下发现：包含一种或多种选自苯磺酸盐(例如苯磺酸钠)、辛酸、己二醇和/或精氨酸的额外组分可进一步改善包含在洗涤溶液中时的杂质的清除(参见图2和3、实施例1)。

因此，在一方面，本文提供一种纯化包含Fc区的多肽的方法，该方法包括以下步骤：在包含Fc区的多肽结合蛋白A的条件下，(a)使蛋白A色谱基质与包含(i)包含Fc区的多肽和(ii)一种或多种杂质的样品接触；和(b)用洗涤溶液洗涤基质，其中洗涤溶液包含(i)浓度为约0.1M至约1.0M的苯甲酸盐和(ii)浓度为约0.5％至约4％体积/体积(v/v)的苯甲醇中的一或两者，并且其中洗涤溶液具有约4.0至约10.0的pH。在一些实施方案中，洗涤溶液包括：(1)苯甲酸盐；(2)苯甲醇；或(3)苯甲酸盐和苯甲醇。在一些实施方案中，苯甲酸盐的浓度为约0.1M至约0.5M。在一些可与任何前述实施方案组合的实施方案中，苯甲酸盐为苯甲酸碱金属盐(benzoate alkali salt)。在一些可与任何前述实施方案组合的实施方案中，苯甲酸盐是苯甲酸钠。在一些实施方案中，苯甲酸钠的浓度为约0.1M至约0.3M。在一些实施方案中，苯甲酸钠的浓度为约0.3M。在一些实施方案中，苯甲酸钠的浓度为约0.5M。在一些可与任何前述实施方案组合的实施方案中，苯甲醇的浓度为约1％至约4％(v/v)。在一些可与任何前述实施方案组合的实施方案中，苯甲醇的浓度为约1％至约2％(v/v)。在一些可与任何前述实施方案组合的实施方案中，苯甲醇的浓度为约2％(v/v)。在一些可与任何前述实施方案组合的实施方案中，苯甲醇的浓度为约4％(v/v)。