[发明专利]配子发生

说明书

本发明涉及通过生成减数分裂胜任细胞来诱导配子发生的活体外方法。还提供用于本发明的所述方法中的试剂和试剂盒。本发明适用于医学领域，特定来说适用于不孕症的研究和治疗。

技术领域

本发明涉及活体外诱导配子发生的方法。还提供用于本发明的所述方法中的试剂和试剂盒。本发明适用于医学领域，特定来说适用于不孕症的研究和治疗。

背景技术

配子发生是借以产生配子的过程。在动物中，配子发生通过性腺(雄性为睪丸；雌性为卵巢)中的减数分裂胜任生殖母细胞的分裂和分化进行。在雄性中，精子发生在睪丸中发生，以在涉及减数分裂和有丝分裂的多步骤过程中由精原干细胞(spermatogonial stemcell,SSC)产生精子。SSC源自产后睪丸中的生殖母细胞，且这些生殖母细胞转而源自原始生殖细胞(primordial germ cell,PGC；Phillips等人,2010)，其在胚胎发生期间迁移至生殖嵴。

在小鼠中，PGC(生殖母细胞的胚胎前体)的特化在胚胎第6.25天(E 6.25)开始¹。在特化之后，新生PGC进行明显的全域表观遗传变化^2-9，包括基因组5-甲基胞嘧啶(5mC)的全域降低^3,6,7,10。PGC在跨发育中胚胎各个期间的迁移之后，一旦到达发育中胚胎性腺，则继续进行包含全域DNA去甲基化的表观遗传再程序化。性腺PGC的这个DNA去甲基化中牵涉的分子机制已成为重点研究的焦点^{3,4,6,12-19,21}，且近年来公开的观测表明，5mC加氧酶Tet1是参与性腺PGC中正确进展DNA去甲基化的关键因子^12,14,16,17。然而，这个表观遗传再程序化的精确性质仍然难以理解。最新研究已显示(Hill等人,2018)，性腺表观遗传再程序化关键性地参与PGC-生殖母细胞的转化，所述转化是产生减数分裂胜任生殖母细胞(且因此允许配子发生的起始)所需要的。重要的是，性腺再程序化过程代表一种直到近年来才仅在性腺体细胞环境下被克服的屏障^5,24,25,27。

最新研究已报道通过若干生殖系相关基因的诱导性表达将体细胞前体细胞转化为减数分裂胜任细胞(Medrano等人,2016)。其它研究已将Tet1鉴定为在雌性配子发生的活化期间调控某些生殖系相关基因方面的关键因子¹⁶。然而，尚未显示对Tet1表达的操纵足以将体细胞前体细胞转化为减数分裂胜任细胞。

在人类中，不孕症是一个重大健康问题。举例来说，雄性不孕症影响7％的群体，其中约10％的不育男性为无精子症(Galdon等人,2016)。减数分裂胜任细胞的提供代表活体外再现配子发生的一个重要步骤，其将应用于研究和医学，特定来说在不孕症的情形下。

发明内容

本发明人已发现，有效活化从PGC进展为生殖系发育的生殖母细胞阶段所需的一组基因(所述基因在本文中和在Hill等人2018中称为“生殖系再程序化应答基因(germlinereprogramming-responsive(GRR)基因)”)需要两个不同生物化学条件。这些基因(也为体细胞前体细胞、多能细胞或早期生殖细胞转化为减数分裂胜任细胞所需的)可通过首先减少DNA甲基化且其次去除多梳蛋白驱动的抑制来活化。一旦这些生物化学条件就位，则包含表观遗传活化因子Tet1的转录因子和活化因子能够驱动GRR基因表达。转录活化因子(如Tet1)的募集和/或GRR基因的表达指示前体(体细胞)细胞转化为减数分裂胜任细胞。

因此，在第一方面中，本发明提供一种生成减数分裂胜任细胞的活体外方法，所述方法包括：

(i)提供前体细胞，

(ii)抑制所述前体细胞的基因组DNA的甲基化，

(iii)用多梳蛋白抑制复合物的抑制剂处理所述前体细胞，且随后

(iv)使所述前体细胞繁殖一段时间且在适合于所述前体细胞变为减数分裂胜任细胞的培养条件下繁殖；