[发明专利]具有对于验证的靶标的二次归巢激活的趋化因子反应性激活的自然杀伤细胞

说明书

本文提供了修饰的NK‑92细胞，其包含可操作地连接于启动子的编码C‑C趋化因子受体7型(CCR7)的核酸。任选地，所述细胞进一步包含编码C‑C基序配体21(CCL21)的核酸、编码C‑C基序配体19(CCL19)的核酸或其组合。还提供了包含修饰的NK‑92细胞的组合物和试剂盒。提供了制备修饰细胞的方法和使用所述细胞治疗癌症的方法。

背景技术

基于过继转移的肿瘤特异性细胞毒性淋巴细胞的癌症免疫疗法有望用于患有恶性肿瘤患者的治疗。尽管这种疗法在某些癌症中取得了早期成功，但肿瘤的治疗仍然是一个挑战，主要是由于肿瘤微环境的免疫抑制性质。除了修饰的T细胞外，正在探索基于NK细胞的免疫疗法。NK-92是一种细胞溶解性癌细胞系，其是在患有非霍奇金淋巴瘤的受试者的血液中发现的，并随后离体永生化。NK-92细胞源自NK细胞，但缺乏正常NK细胞呈现的主要抑制性受体，同时保留了大部分激活受体。然而，NK-92细胞不攻击正常细胞，也不会在人体中引起无法接受的免疫排斥反应。

淋巴结转移的常见驱动因素是缺氧驱动的CCR7上调，CCR7是一种主要存在于原始T细胞和树突状细胞中的趋化因子受体。先前已经证明了血液NK细胞上的CCR7受体的上调改善NK细胞向淋巴结的归巢，使它们遵循作为转移性扩散的共同途径的相同路径至淋巴结区室，但尚未在临床上相关的细胞系中得到证明。

发明内容

本文提供了修饰的NK-92细胞，其包含可操作地连接于启动子的编码C-C趋化因子受体7型(CCR7)的核酸。任选地，细胞还包含编码C-C基序配体21(CCL21)的核酸、编码C-C基序配体19(CCL19)的核酸或其组合。还提供了包含修饰的NK-92细胞的组合物和试剂盒。提供了制备修饰的细胞的方法和使用该细胞治疗癌症的方法。

一个或多个实施方式的细节在附图和以下描述中阐述。根据说明书和附图以及根据权利要求书，其他特征、目的和优点将是显而易见的。

附图说明

图1是示意图，显示了NK-92细胞中用于在AAVS1基因座处插入的含有CCR7受体的质粒pNKAT-CCR7-LP3。

图2是示意图，显示了将用于通过替代图1质粒的第一插入的嘌呤霉素选择盒将NFAT反应性CCL21基因顺序整合到NK-92细胞中的质粒pCRENFAT-CCL21。

图3是显示了野生型NK-92细胞中和表达CCR7的修饰的NK-92细胞中与NK-92细胞相关的表型标志物的表达的图。(泳道1：aNK(野生型)；泳道2：修饰的NK-92细胞(MA3)；泳道3：修饰的NK-92细胞(MB4)；泳道4：修饰的NK-92细胞(MB6)；泳道5：修饰的NK-92细胞(ME6)；泳道6：修饰的NK-92细胞(MH3)；A：同种型(APC)；B：CD54(ICAM-1)；C：NKp30；D：NKG2D)。

图4是显示了表达CCR7的修饰NK-92细胞对K562细胞的细胞毒性活性的图。

图5是显示了表达CCR7的修饰NK-92细胞对HL-60细胞的细胞毒性活性的图。

图6A和6B是显示了在靶向结合K562和Sup-B15的情况下证明的NFAT激活的图(在细胞用CD19-CAR的mRNA电穿孔时)。

图7是显示了表达CCR7的修饰NK-92细胞朝向趋化因子CCL19和CCL21迁移的图。

图8是显示了表达CCR7的细胞朝向表达CCL19的K-19细胞迁移的图。

图9A和9B是显示CCR7迁移的体内分析的图。图9A显示了给药表达CCR7的NK-92细胞后3小时归巢至具有CCL19的肿瘤的明显提高。图9B显示了在24小时时，四只小鼠中的三只中表达CCR7的NK-92细胞至分泌CCL19的肿瘤的募集增加。