[发明专利]一种用于肿瘤光热治疗联合免疫治疗的抗体偶联硒化铋纳米颗粒及其制备方法

权利要求书

1.一种用于肿瘤光热治疗联合免疫治疗的抗体偶联硒化铋纳米颗粒的制备方法，其特征在于，该抗体偶联硒化铋纳米颗粒以氨基化的硒化铋为载体，PEG为交联剂，PEG将抗CD47抗体偶联于纳米颗粒表面；

抗CD47抗体与高表达CD47分子的肿瘤细胞进行特异性识别，封闭肿瘤细胞表面CD47分子与巨噬细胞表面的信号调节蛋白α链(SIRPα)的相互作用，从而使巨噬细胞重新获得吞噬肿瘤细胞的能力；在静脉注射该抗体偶联硒化铋纳米粒悬液后，纳米粒通过EPR效应大量靶向聚集在肿瘤部位，避免抗CD47抗体全身给药而引起的贫血；特别是在光热治疗后，残余的肿瘤细胞会因为“不吃我”信号通路被封闭而被巨噬细胞清除，达到彻底根除肿瘤的目的；

所述的制备方法包括以下步骤：

第一步，合成硒化铋纳米颗粒

1.1)将铋盐完全溶解于硝酸溶液中，并加入氢氧化钠调节反应体系PH；室温下，将聚乙烯吡咯烷酮与乙二醇混合搅拌得到混合溶液；然后混合上述两种溶液继续搅拌不低于30min；

1.2)将步骤1.1)得到的混合液移至高压反应釜中，130-170℃水热反应2h-5h后得到乳白色液体，反应液用去离子水清洗干燥后得到氧化铋纳米粒子；

1.3)室温下，将氧化铋纳米粒子溶于水中，加入硒源搅拌后，再向其中加入氧化剂，得到反应液，反应液中硒化铋纳米颗粒的浓度为(7～10)mg/mL；最后将反应体系移至高压反应釜中，130-180℃水热反应8h-24h后，得到黑褐色液体，反应溶液用去离子水与乙醇清洗、烘干得到硒化铋纳米颗粒；

第二步，合成PEG偶联的硒化铋纳米颗粒

2.1)室温下，将硒化铋纳米颗粒溶于水溶液中的，得到浓度为2.5mg/mL的硒化铋溶液；再将硒化铋溶液加入无水乙醇中搅拌均匀后，再加入三氨丙基三甲氧基硅烷APTMS，并加入氨水保证反应在碱性条件下进行，避光搅拌24-36h使其充分反应，得到反应液；将反应液用无水乙醇和去离子水清洗、冷冻干燥得到氨基化的硒化铋纳米颗粒；

2.2)PEG₂₀₀₀用EDC与NHS活化0.5-4h，所述的PEG₂₀₀₀与EDC的摩尔比为1:(1.5-4)；PEG₂₀₀₀与NHS的摩尔比为1:(1.5-4)；

2.3)在活化好的PEG₂₀₀₀中加入步骤2.1)得到的氨基化硒化铋纳米粒子，室温条件下搅拌24-36h得到PEG-Bi₂Se₃，所得反溶液中PEG的浓度为5-10mg/mL；

第三步，合成抗体偶联的硒化铋纳米颗粒

3.1)将2.3)得到的反应液用EDC与NHS活化0.5-4h，并溶解于PBS溶液中；所述的PEG₂₀₀₀与EDC的摩尔比为1:(1.5-4)；PEG₂₀₀₀与NHS的摩尔比为1:(1.5-4)；

3.2)将抗CD47抗体加入上述溶液中，在4℃-24℃下搅拌24-36h，得到抗CD47抗体偶联的PEG-Bi₂Se₃纳米粒子，抗CD47抗体与PEG质量之比为1：(300～700)，所得纳米粒子中抗CD47抗体的浓度为1-10μg/mL。

2.根据权利要求1所述的一种用于肿瘤光热治疗联合免疫治疗的抗体偶联硒化铋纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述的第一步步骤1.1)中，每1g铋盐对应加入20～30mL硝酸溶液；每1g铋盐对应加入100～200mL乙二醇溶液；铋盐与聚乙烯吡咯烷酮的质量比为1:(2～4)。

3.根据权利要求1或2所述的一种用于肿瘤光热治疗联合免疫治疗的抗体偶联硒化铋纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述的第一步步骤1.3)中，所述的硒源为Na₂SeO₃，氧化剂为葡萄糖；所述的硒源与葡萄糖的质量比为1：(2～4)；所述的氧化铋纳米粒子与硒源质量比为1:(0.3-0.8)。

4.根据权利要求1或2所述的一种用于肿瘤光热治疗联合免疫治疗的抗体偶联硒化铋纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述的第二步步骤2.1)中，每4-20mL的无水乙醇对应加入2-10mL的硒化铋溶液、0.5-2.5mL的APTMS、2mL-10mL的氨水。

5.根据权利要求3所述的一种用于肿瘤光热治疗联合免疫治疗的抗体偶联硒化铋纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述的第二步步骤2.1)中，每4-20mL的无水乙醇对应加入2-10mL的硒化铋溶液、0.5-2.5mL的APTMS、2mL-10mL的氨水。