[发明专利]一种石油烃降解菌降解石油烃能力的微量化检测方法

说明书

本发明提供一种石油烃降解菌降解石油烃能力的微量化检测方法，所述方法包括(1)在96孔微板的反应孔中依次加入碳源底物、含显色剂的石油烃降解培养基及石油烃降解菌液；(2)将步骤(1)中已经接种的96孔微板进行恒温培养，并于波长590nm处测定96孔微板中已接种反应孔的吸光度值；(3)计算96孔微板中每个时间点已接种反应孔颜色的相对变化率；(4)根据所述每个时间点已接种反应孔颜色的相对变化率判断石油烃降解菌降解石油烃能力。该方法成本低廉，不需要加入大量药剂，检测仅需微升试剂，可以避免药品的浪费及对环境的污染，操作步骤少。

技术领域

本发明涉及一种石油烃降解菌降解石油烃能力的微量化检测方法，属于微生物应用技术领域。

背景技术

石油生产、贮运、炼制加工及使用过程中，由于事故、不正常操作及检修等原因造成石油类的溢出和排放，使得油田及炼化场地石油污染严重。石油类物质具有致癌、致变、致畸等活性，威胁人类的生存和健康。在石油污染土壤的修复方法中，微生物修复技术被认为是一种治理石油污染土壤的有效策略。微生物对石油烃降解的能力是影响修复效果的关键。

目前，用来检测石油烃降解菌的降油能力的方法主要是微生物计数和摇瓶法。其中，微生物计数法是采用平板计数法测定降解菌在原油、石油、柴油及烃类物质为单一底物的环境下数量的变化，摇瓶法是通过测定降解菌对石油类物质的降解率来判断石油烃降解菌的降解能力，但是上述两种方法均耗时、且药剂毒性大、耗用药品多，实验占用空间大。

Biolog技术可进行95种唯一碳源的生化反应测试。当在96孔板上接种培养的菌液时，其中一些孔的营养物质被利用，使孔中呈现不同颜色，此技术可以广泛应用于微生物的鉴定及微生物群落功能多样性的研究。通过显色反应可以评价微生物的代谢活力及对各种碳源的利用能力。但目前Biolog针对微生物对石油类碳源的利用能力的评价技术尚未开发。鉴于此，中国专利CN106544395A公开了一种利用Biolog MT2微孔板测定土壤中微生物对石油烃降解能力的方法，但MT2预制板价格较高，不适合高通量测定。而且该专利只是针对土壤中的微生物，对筛选出的纯菌对石油烃的降解能力的评价并未提及，另外，此专利并未提及微生物对原油及成品油污染的降解能力的检测，因此有必要开发一种简单可行、成本低廉的技术用于评价微生物对石油类碳源的利用能力。

发明内容

为了解决上述的缺点和不足，本发明的一个目的在于提供一种石油烃降解菌降解石油烃能力的微量化检测方法。本发明针对目前本领域石油烃降解菌(菌群)降解石油烃的检测方法操作过程复杂等问题，提供了该石油烃降解菌降解石油烃能力的微量化检测方法，此方法具有操作过程简单、试剂消耗少、产生废液少，测定通量高等优点。

为了达到以上目的，本发明提供了一种石油烃降解菌降解石油烃能力的微量化检测方法，其中，该方法包括以下步骤：

(1)在96孔微板的反应孔中依次加入碳源底物、含显色剂的石油烃降解培养基及石油烃降解菌液；

(2)将步骤(1)中已经接种的96孔微板进行恒温培养，并于波长590nm处测定96孔微板中已接种反应孔的吸光度值；

(3)计算96孔微板中每个时间点已接种反应孔颜色的相对变化率；

(4)根据所述每个时间点已接种反应孔颜色的相对变化率判断石油烃降解菌降解石油烃能力。

在本发明的具体实施方式中，本领域技术人员可以根据现场作业需要选择在96孔微板的不同反应孔中依次加入不同的碳源底物、含显色剂的石油烃降解培养基及不同的石油烃降解菌液，以实现同时测定多组石油烃降解菌对不同碳源底物的降解；同时，也可以在不同反应孔中依次加入相同的碳源底物、含显色剂的石油烃降解培养基及相同石油烃降解菌液，以进行平行(重复)实验。

根据本发明具体实施方案，在所述的方法步骤(1)中，96孔微板的反应孔中，所述碳源底物、含显色剂的石油烃降解培养基及石油烃降解菌液的总体积不超过180μL。