[发明专利]一种具有高分泌能力的普鲁兰酶及其应用

说明书

本发明公开了一种具有高分泌能力的普鲁兰酶及其应用，属于酶工程和微生物工程技术领域。本发明的普鲁兰酶胞外分泌能力高，将携带本发明普鲁兰酶的大肠杆菌摇瓶发酵48h，可使发酵液中的总酶活力达212.0U·mL^‑1，其中，胞外酶活达200.5U·mL^‑1，占了总酶活力的94.5％，因此，本发明的普鲁兰酶容易发酵制备，可以显著降低发酵工艺控制难度及成本；本发明的普鲁兰酶作用条件温和，能够在温度40～60℃，pH 6.0～7.5的条件下水解淀粉中的α‑1,6‑葡萄糖苷键，因此，本发明的普鲁兰酶在工业转化中能够降低成本，在食品、淀粉糖等行业中具有潜在利用价值。

技术领域

本发明涉及一种具有高分泌能力的普鲁兰酶及其应用，属于酶工程和微生物工程技术领域。

背景技术

普鲁兰酶，又名普鲁兰多糖-6-葡聚糖水解酶(pullulan-6-glucanohydrolase)，是一种能够专一性切割普鲁兰多糖(普鲁兰多糖是由α-1,4-糖苷键连接的麦芽三糖重复单元经α-1,6-糖苷键聚合而成的直链状多糖)、支链淀粉、以及支链糊精中的α-1,6葡萄糖苷建的水解酶。

普鲁兰酶根据作用糖苷键类型的差异主要被分为2类：Ⅰ型普鲁兰酶和Ⅱ型普鲁兰酶。其中，Ⅰ型普鲁兰酶(EC 3.2.1.41)具有水解普鲁兰多糖和分支糊精中α-1,6-葡萄糖苷键活力，不具有α-1,4-葡萄糖苷键水解活力；Ⅱ型普鲁兰酶，又被称为淀粉普鲁兰酶(amylopullulanase，EC3.2.1.1/41)，其既可以作用于普鲁兰多糖中的α-1,6-葡萄糖苷键，也能水解支链淀粉或一些糊精中的α-1,4-糖苷键，但是不能作用于普鲁兰多糖中的α-1,4-葡萄糖苷键。

因此，普鲁兰酶常与如糖化酶、β-淀粉酶等的其他淀粉酶协同作用或单独作用，用于葡萄糖浆、麦芽糖浆、超高麦芽糖浆、海藻糖等的制备中，在食品、医药、发酵等领域均占据重要的地位。

但是，由于普鲁兰酶蛋白分子普遍偏大，一般含有900个以上的氨基酸，单亚基分子量约在106kDa；此外，普鲁兰酶单亚基通常含有6个结构域，并含有一些特有的氨基酸序列，这导致了普鲁兰酶极易形成包涵体，难以分泌到胞外，胞外表达水平低。

因此，目前为止，国内外在普鲁兰酶开发中仍然存在很多问题，其中，普鲁兰酶可溶性分泌水平不足导致的发酵单位低是影响其规模化制备的关键因素之一。例如，邓毅等人将来源于B.naganoensis的酸性普鲁兰酶在芽孢杆菌中表达后，其酶活只有26.5U·mL^-1；甄杰等人将来源于Anoxybacillus sp.LM18-11中的普鲁兰酶基因在枯草芽孢杆菌中表达后，虽然相比初始菌种表达活力有所提高，但是胞外酶活也只有42U·mL^-1；吴丽双等人将来源于B.acidopullulyticus中的普鲁兰酶基因进行密码子优化后，转入毕赤酵母中进行表达，最终胞外酶活只有0.4U·mL^-1，远远达不到工业生产的要求。

并且，普鲁兰酶胞外表达水平低的问题，会大大提高发酵生产发酵普鲁兰酶时后续产物分离提取的难度，进一步提高工业生产成本，阻碍了普鲁兰酶的进一步推广应用。

发明内容

[技术问题]

本发明要解决的技术问题是得到一种具有高分泌能力，尤其是高胞外分泌能力的普鲁兰酶，以提高普鲁兰酶的产量，同时，降低普鲁兰酶分离提取的难度。

[技术方案]

为解决上述问题，本发明提供了一种具有高分泌能力的普鲁兰酶，所述普鲁兰酶的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。