[发明专利]一种基于声致微流的冷冻防护剂导入去除微系统和方法、及细胞的低温保存方法

说明书

本发明公开了一种基于声致微流的冷冻防护剂导入去除微系统，包括声表面波器件，对声表面波器件的部分表面进行疏水处理，形成疏水表面区域，在该疏水表面区域完成将冷冻防护剂导入细胞和/或将冷冻防护剂从细胞中去除。还公开了一种基于声致微流的冷冻防护剂导入去除方法，和一种细胞的低温保存方法。该冷冻防护剂导入去除系统和方法利用声致微流效应完成冷冻防护剂与胞内水的置换，以实现将CPA导入到细胞内或从细胞中去除，降低了传统手动操作方式对细胞造成的渗透压冲击和机械损伤。该低温保存方法能够更好地保存细胞的形态和完整性，提高细胞的存活率，适合微量细胞的低温保存。

技术领域

本发明属于细胞低温保存技术领域，具体涉及一种基于声致微流的冷冻防护剂导入去除微系统，一种利用该冷冻防护剂导入去除微系统的冷冻防护剂导入去除方法，以及一种利用该冷冻防护剂导入去除方法的细胞的低温保存方法。

背景技术

在临床应用中，普遍需要大量新鲜细胞供医疗使用，这便涉及到如何培养和保存细胞的问题。细胞低温保存(cryopreservation)技术是一种能有效延长细胞寿命的方法，且细胞的形态、完整性、功能等在保存过程中不受破坏。细胞低温保存技术的一个典型应用就是脐带间充质干细胞(umbilical cord matrix mesenchymal stem cells(hUCM-MSCs))的保存。由于间充质干细胞具有可再生的能力，使得其在细胞疗法中具有广泛的应用。但是临床应用前需要将此类干细胞低温保存，避免细胞出现染色体异常、恶性转化或功能受损等情况。

在低温保存技术中，需要使用冷冻防护剂(cryoprotective agent,CPA)抑制细胞在冷冻和解冻过程中胞内冰(intracellular ice)的形成，因此在进行液氮低温保存前，需要将CPA导入(loading)到细胞中。由于CPA具有毒性，细胞进入临床使用前，需要将CPA从细胞中彻底去除(unloading)。传统CPA导入和去除的方法，采用试管，手动操作来完成。

具体地，CPA的导入和去除需要分成多步实现，每一步将不同浓度的CPA溶液与细胞溶液进行混合，通过手动摇晃试管使溶液充分混合，细胞壁内外CPA的浓度差导致CPA向细胞内扩散，置换胞内水。通过依次递增CPA浓度，可以将胞内水彻底置换成CPA。传统方式手动操作，耗时很长、对细胞产生的渗透压冲击和机械损伤(细胞与吸液管壁碰撞造成的)大，使得细胞的形态、完整性得到破坏，从而降低了细胞的存活率。还可能引入人为操作失误，生物交叉污染等。传统方式使用试管操作，因此不适用于微量细胞的操作和冷冻保护。

因此，迫切需要一种新的高效CPA导入和去除系统及细胞低温保存方法来解决上述问题，实现CPA的高效导入和去除，及细胞的快速冷冻，在整个低温保存过程中较好地保持细胞的形态、完整性，提高细胞的存活率。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于声致微流的冷冻防护剂导入去除微系统，该冷冻防护剂导入去除微系统利用声表面波器件的声致微流作用完成冷冻防护剂与胞内水的置换，实现将冷冻防护剂导入细胞和将冷冻防护剂从细胞中去除，降低了传统手动操作方式对细胞造成的渗透压冲击和机械损伤。

本发明的另一目的是提供一种基于声致微流的冷冻防护剂导入去除方法，该冷冻防护剂导入去除方法利用了上述冷冻防护剂导入去除微系统，分成多步将具有浓度差的冷冻防护剂与细胞培养液混合，降低了传统手动操作方式对细胞造成的渗透压冲击和机械损伤。

本发明的再一目的是提供一种细胞的低温保存方法，该细胞的低温保存方法利用了上述冷冻防护剂导入去除方法，因此，能够更好地保存细胞的形态和完整性，提高细胞的存活率。

为实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

一种基于声致微流的冷冻防护剂导入去除系统，包括声表面波器件，对声表面波器件的部分表面进行疏水处理，形成疏水表面区域，在该疏水表面区域完成冷冻防护剂与胞内水的置换，实现将冷冻防护剂导入细胞和/或将冷冻防护剂从细胞中去除。