[发明专利]一种HIV耐药检测载体和构建方法

权利要求书

1.一种HIV耐药检测载体，其特征在于，所述HIV耐药检测载体的构建方法，包括以下步骤：

1)将载体pLWJ-SV40-Luc+与LacZ基因进行第一In-fusion连接，得到载体pLWJ-SV40-Luc-LacZ；

2)将所述步骤1)得到的载体pLWJ-SV40-Luc-LacZ与耐药检测基因进行第二In-fusion连接，得到HIV耐药检测载体；

所述耐药检测基因为HIV-1病毒Gag-Pol区第1678bp到第5042bp之间的基因。

2.根据权利要求1所述的HIV耐药检测载体，其特征在于，所述步骤1)第一In-fusion连接使用的体系每10μL包括：5×In-fusion 2μL，浓度为30ng/μL的载体pLWJ-SV40-Luc+2.5μL，浓度为10ng/μL的LacZ基因1.5μL，ddH₂O4μL。

3.根据权利要求2所述的HIV耐药检测载体，其特征在于，所述步骤1)第一In-fusion连接的条件包括：所述连接的温度为45～55℃，所述连接的时间为10～20min。

4.根据权利要求2所述的HIV耐药检测载体，其特征在于，所述步骤1)载体pLWJ-SV40-Luc+经过AgeI和AarI双酶切后再进行连接。

5.根据权利要求1所述的HIV耐药检测载体，其特征在于，所述步骤1)LacZ基因扩增使用的体系每50μL包括：5×primer STAR GXLBuffer 10μL，dNTP Mixture 4μL，GXLDNAPolymerase 1μL，浓度为20μM的5InLacZ引物1μL，浓度为20μM的3InLacZ引物1μL，浓度为0.1ng/μL的载体pUC195μL，ddH₂O 28μL；

所述5InLacZ引物具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；

所述3InLacZ引物具有SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。

6.根据权利要求1或5所述的HIV耐药检测载体，其特征在于，所述步骤1)LacZ基因扩增的程序包括：98℃2min；98℃10s，55℃15s，68℃30s，30个循环；68℃10min。

7.根据权利要求1所述的HIV耐药检测载体，其特征在于，所述步骤2)第二In-fusion连接使用的体系每10μL包括：5×In-fusion 2μL，浓度为30ng/μL载体pLWJ-SV40-Luc-LacZ2.5μL，浓度为10ng/μL耐药检测基因1.5μL，ddH₂O 4μL。

8.根据权利要求1或7所述的HIV耐药检测载体，其特征在于，所述步骤2)第二In-fusion连接的条件包括：所述连接的温度为45～55℃，所述连接的时间为10～20min。

9.根据权利要求7所述的HIV耐药检测载体，其特征在于，所述步骤2)载体pLWJ-SV40-Luc-LacZ经过AgeI和AarI双酶切后再进行连接。

10.权利要求1～9任意一项所述的HIV耐药检测载体的构建方法，包括以下步骤：

1)将载体pLWJ-SV40-Luc+与LacZ基因进行第一In-fusion连接，得到载体pLWJ-SV40-Luc-LacZ；

2)将所述步骤1)得到的载体pLWJ-SV40-Luc-LacZ与耐药检测基因进行第二In-fusion连接，得到HIV耐药检测载体；

所述耐药检测基因为HIV-1病毒Gag-Pol区第1678bp到第5042bp之间的基因。