[发明专利]一种HIV耐药检测载体和构建方法

说明书

本发明HIV耐药检测载体，属于基因工程技术领域，构建方法包括：将载体pLWJ‑SV40‑Luc+与LacZ基因进行第一In‑fusion连接，得到载体pLWJ‑SV40‑Luc‑LacZ；将载体pLWJ‑SV40‑Luc‑LacZ与耐药检测基因进行第二In‑fusion连接，得到HIV耐药检测载体；所述耐药检测基因为受检样本中HIV病毒Gag‑Pol区第1678bp到第5042bp之间的基因。采用本发明提供的HIV耐药检测载体可同时检测HIV‑1逆转录酶、蛋白酶和整合酶抑制剂在内的Gag‑Pol区第1678bp到第5042bp之间的基因，能涵盖目前绝大多数艾滋病抗病毒治疗药物的主要作用靶点，实现高通量检测。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种HIV耐药检测载体和构建方法。

背景技术

随着艾滋病抗病毒治疗的广泛开展，HIV耐药的出现和重要性已成为日益关注的热点，亟须加以预防和控制。福建省于2005年启动免费抗病毒治疗工作，至2017年底全省已累计为10299个病人提供免费抗病毒治疗，耐药监测结果显示：福建省抗病毒治疗失败患者对NRTI、NNRTI和PI的耐药率分别是54.5％(72/132)、67.4％(89/132)、5.3％(7/132)。HIV耐药性已逐渐成为威胁抗病毒治疗可持续性发展的主要因素。国际AIDS协会已推荐将病毒耐药性检测纳入AIDS的临床管理中，并建议对新发感染者、抗病毒治疗失败的病人及孕妇感染者进行病毒耐药性检测。HIV耐药性检测是指导抗HIV临床管理和抗病毒治疗失败后重新制定治疗方案的主要技术手段；在临床治疗方面，耐药性检测结果能很好地指导用药，有效降低初始治疗失败的风险；制定良好规范，指导程序服药，是目前减少耐药产生的最有效方法。另外，耐药性检测对于控制HIV-1耐药株的流行传播，了解某一流行区域HIV-1的耐药性，具有重大的社会意义。

目前国际上发展较为成熟并且应用于临床的有基因型和表型耐药检测。基因型检测具有多种优点，如简便、快速、费用低，在HIV-1耐药性检测使用频率方面高于表型耐药性检测，但是基因型检测也存在一定局限性，如应用PCR方法只能扩增出患者体内的优势株，耐药突变位点之间的联合耐药效应与单独耐药突变位点的耐药效应具有较大差异等，因此基因型检测在判定和解释耐药结果方面具有一定局限。相对于基因型耐药检测，表型耐药检测可以更为准确直观地反映病毒对药物的敏感性，并能揭示事先存在或交叉的耐药情况,对于基因突变类型比较复杂、基因型结果解释不明了、多种治疗方案失败导致的多位点耐药性突变，新的可疑耐药突变位点的鉴定以及包括细胞在内新药的敏感性检测，这些表型检测的作用是基因检测所不可替代的。当然相对而言，表型检测也存在着繁琐、慢和高费用等缺点。

目前建立的HIV-1表型耐药检测方法主要有基于真病毒的表型耐药检测(包括传统病毒培养法和改良细胞法)和基于假病毒的表型耐药检测。前者必须在生物安全Ⅲ级实验室进行，这不利于大规模开展基础和应用研究。后者主要基于将反转录－PCR扩增的患者HIV-1蛋白酶(PR)和反转录酶(RT)区基因插入载体中，同时利用其他病毒的包膜糖蛋白而产生重组假病毒进行表型耐药检测。该方法只有单轮感染能力，不具有复制能力，方法的安全性较高，可以在生物安全II级实验室进行。随着HIV病毒亚型的增多以及新抗病毒药物的增加,特别是新耐药位点和多位点联合耐药病毒株的出现，对现有表型耐药性检测技术的应用提出了很大的挑战。表现在如下三个方面。

1.目前表型耐药检测范围主要是针对逆转录酶和蛋白酶主要酶活性区域。然而随着整合酶抑制剂、融合抑制剂等新药不断推广应用，针对新药的HIV耐药相关突变位点的出现将不可避免。此外，目前除了药物主要作用靶点检测到耐药突变外，还在HIV-1连接区、Gag区蛋白酶剪切位点处(p7/p1/p6)检测到耐药相关突变位点的存在。因此，有必要扩大耐药检测范围，尽可能涵盖对病毒所有酶区、所有药物靶点及其相互作用检测的要求。

2.先前建立的表型耐药检测方法主要采用酶切连接克隆，连接效率低，耗时较长，需要特定限制性酶切位点，应用上有所受限。因此，有必要探索利用新的高通量克隆技术应用于表型耐药检测，真正实现快速、高通量、无缝连接。