[发明专利]一种重组病毒样颗粒及其制备方法和用途

说明书

本发明提供了一种重组病毒样颗粒及其制备方法和用途，所述方法包括如下步骤：将表达重组病毒衣壳蛋白的细胞进行发酵后收集发酵产物，采用2‑6M的脲溶液溶解解聚，胞外二次组装得到重组病毒衣壳蛋白的完整病毒样颗粒。本发明的重组乙肝病毒核心抗原颗粒的制备方法，将硫酸铵沉淀的重组衣壳蛋白在相对温和条件下溶解并解聚、纯化、最后胞外二次组装形成具有天然结构的病毒样颗粒。该方法简单、高效，所制备的重组乙肝病毒核心抗原颗粒具有结构完整、均一且不含宿主核酸和杂蛋白的优点，具有重要意义和广阔的应用前景。

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，涉及一种重组病毒样颗粒及其制备方法和用途，主要涉及一种可溶形式表达的重组病毒样颗粒及其制备方法和用途，具体涉及一种重组乙肝病毒核心抗原颗粒及其制备方法和用途。

背景技术

乙肝病毒核心抗原(HBc)是单链衣壳蛋白，可独自组成无核酸的正二十面体结构，具有与天然病毒类似的形态，大小约28nm。其主要免疫显性区域(MIR)位于颗粒的表面形成刺突，能够有效的递呈抗原，激发强烈的体液免疫和细胞免疫。此外在其MIR区插入或替换为一段其它抗原，并不会影响其形成病毒样球形颗粒结构。这些优点使得HBc成为病毒样颗粒(VLP)中最具有用途前景的疫苗载体。另一方面不含核酸的HBc-VLP纳米尺寸的空心结构能够高效装载小分子药物或者显影剂，在药物递送和临床诊断方面具有广阔的用途前景。

目前，HBc-VLP已经在重组真核细胞和原核细胞中成功获得表达，前者如非洲爪蟾蛙卵母细胞、植物本氏烟以及毕赤酵母等，后者如大肠杆菌。由于病毒样颗粒结构的复杂性，传统制备多采用真核表达系统进行培养表达，利用高等细胞自身的蛋白加工能力，在胞内完成颗粒组装，然后以组装体的形式与宿主的其它杂质分离。但这种制备策略存在以下问题：一是胞内组装的颗粒存在结构不均一、颗粒不完整的现象，无论是由非洲爪蟾蛙细胞、植物还是酵母细胞表达，其产物除完整颗粒外，还存在大量的二聚体、组装中间体甚至是错误组装的结构，导致直接纯化后的疫苗质量低，活性低，且易于聚集稳定性低。二是纯化过程容易破坏颗粒组装体结构，由于颗粒组装体蛋白间的作用力较弱，与介质吸附洗脱的相互作用会对组装体的结构造成破坏，使部分颗粒解聚，导致纯化收率及活性大幅降低。三是部分杂质不易除去，直接纯化的疫苗产品存在安全隐患，无论对哺乳动物细胞还是昆虫细胞，在胞内进行组装时很容易将宿主DNA或RNA以及宿主蛋白包裹于内部，胞内组装的蛋白颗粒还可能和宿主蛋白结合在一起。为了去除此类杂质，均需要打开宿主蛋白与颗粒的结合以及打开原有颗粒结构，这必然会对完整组装体的结构带来改变和破坏，以至于颗粒完全解聚。

与一级氨基酸序列决定蛋白空间构象相同，病毒衣壳蛋白的独特理化性质决定了衣壳蛋白具有在胞外自组装成病毒样颗粒的能力。采用先纯化亚基单元后组装颗粒能避免层析过程对组装体结构的破坏，能彻底去除宿主核酸等杂质，通过胞外二次组装还能显著改善颗粒形貌，提高均一性等，因此采用胞外自组装方法有望解决传统疫苗制备出现的上述问题。已有文献报道，大肠杆菌表达的重组HBc蔗糖梯度密度离心结果显示超离样品中HBc沉降系数呈现非常宽的分布，存在大量的二聚体等未组装结构，表明产物结构的严重不均一。因此HBc-VLP的制备采取胞外自组装技术是非常必要的，以期达到高效、纯净、颗粒完整、结构均一的目的。

“Wizemann,H.and Brunn,A.V.,Purification of E.coli-expressed HIS-tagged hepatitis B core antigen by Ni²⁺-chelate affinity chromatography,Journal of Virological Methods,1999,189-197”公开了一种体外组装病毒样颗粒的方法，截短的HBc-VLP能够在2M脲，pH 9.5条件下解聚，Ni FF纯化后组装得到VLP，遗憾的是，这种方法无论是纯化还是组装均收率较低，最后的产品质量也不高。

CN 101848730 A公开了将上述方法用于融合HBc-VLP的制备，主要是在变性剂尿素或盐酸胍存在条件下纯化，然后再重组装形成VLP，但现有方法不能得到与天然结构相似的类病毒样HBc颗粒。