[发明专利]一种抑制马克斯克鲁维酵母目的基因的表达的载体

说明书

本发明公开了一种抑制马克斯克鲁维酵母目的基因的表达的载体。该载体的核苷酸序列如序列表中序列1所示。根据HSF1基因转录起始位点的核苷酸序列，设计靶向HSF1基因的sgRNA特征序列(核苷酸序列如序列表中序列2所示)；将载体自5’至3’起第11868至11875位所示的DNA小片段替换为序列表中序列2所示的核苷酸序列的反向互补序列，得到重组质粒；向马克斯克鲁维酵母中导入重组质粒，得到重组马克斯克鲁维酵母。与马克斯克鲁维酵母相比，重组马克斯克鲁维酵母中HSF1基因的相对表达量显著降低。由此可见，本发明提供的载体可以用于抑制马克斯克鲁维酵母目的基因的表达。本发明具有重要的应用价值。

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种抑制马克斯克鲁维酵母目的基因的表达的载体。

背景技术

马克斯克鲁维酵母(Kluyveromycesmarxianus)能够在高达45℃条件下生长并进行乙醇发酵，其在分类学上与酿酒酵母具有一定的亲缘性，并与乳酸克鲁维酵母一样获得美国食品添加剂的安全性指标(Generally Regarded as Safe，GRAS)认证和欧洲“安全资格认定”(Qualified Presumption of Safety，QPS)认证。与前两者相比，马克斯克鲁维酵母因其可利用底物广泛、生长速率快、耐热、蛋白分泌能力强以及更适合于生物工程改造与应用而备受工业生产的青睐。

CRISPR/Cas9系统是原核微生物(细菌和古生菌)抵御外部遗传元件(如质粒和噬菌体)的一种免疫系统。其中，CRISPR即成簇规律间隔短回文重复序列(Clusteredregularly-interspaced short palindromic repeats)的英文缩写，Cas为CRISPR关联蛋白(CRISPR-associated)的英文缩写。CRISPR/Cas9系统仅仅依赖单一蛋白Cas9，由一个crRNA(CRISPR-derived RNA)和一个tracrRNA(trans-activating RNA)融合形成的sgRNA(single guide RNA)引导Cas9对DNA上与sgRNA互补的目的DNA中前20个nt靶定特征序列进行识别与切割，从而引入一个DNA双键断裂(DSB)。研究表明，通过失活Cas9的核酸内切酶的活性而获得了dead Cas9(dCas9)，dCas9只会在sgRNA的引导下特异性的结合到目的位点，而不会产生切割。

发明内容

本发明的目的是在马克斯克鲁维酵母中抑制目的基因表达。

本发明首先保护一种载体，可包括表达盒甲和表达盒乙；

所述表达盒甲依次可包括如下元件：启动子甲、dCas9蛋白的编码基因、转录抑制因子和终止序列甲；

所述表达盒乙依次可包括如下元件：启动子乙、sgRNA骨架结构和终止序列乙。

所述启动子甲和所述启动子乙可以相同，也可以不同。

所述终止序列甲和所述终止序列乙可以相同，也可以不同。

所述表达盒甲中，dCas9蛋白的氨基酸序列可如序列表中的序列6所示。dCas9蛋白的编码基因可如序列表中序列1自5’末端起第7165至11265位所示。

所述表达盒甲中，转录抑制因子可为转录抑制因子Mxi1。所述转录抑制因子Mxi1的核苷酸序列可如序列表中序列1自5’末端起第11329至11454位所示。

所述表达盒甲中还可包括一个以上细胞核定位序列。所述细胞核定位序列可为细胞核定位序列SV40。细胞核定位序列SV40的氨基酸序列可为Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val。