[发明专利]一种肺炎克雷伯菌抗体ELISA快速检测试剂盒及检测方法

权利要求书

1.一种肺炎克雷伯菌抗体ELISA快速检测试剂盒，其特征在于，包括：包被抗原、包被缓冲液、2％BSA封闭液、PBST洗涤缓冲液、一抗阳性血清、阴性对照血清、样品稀释液、酶标二抗、底物显色液和终止液；

所述包被抗原为用包被缓冲液稀释成浓度为10⁷～10⁹cfu/mL的病原菌液；

所述一抗阳性血清是以肺炎克雷伯菌为抗原，免疫水貂获得的血清；

所述阴性对照血清为未进行免疫的水貂血清。

2.根据权利要求1所述的一种肺炎克雷伯菌抗体ELISA快速检测试剂盒，其特征在于，所述包被缓冲液为0.05M的碳酸盐缓冲液，pH为9.6。

3.根据权利要求1所述的一种肺炎克雷伯菌抗体ELISA快速检测试剂盒，其特征在于，所述2％BSA封闭液为质量浓度1～5％的牛血清蛋白溶液。

4.根据权利要求1所述的一种肺炎克雷伯菌抗体ELISA快速检测试剂盒，其特征在于，所述PBST洗涤缓冲液为0.15M的PBS溶液。

5.根据权利要求1所述的一种肺炎克雷伯菌抗体ELISA快速检测试剂盒，其特征在于，所述样品稀释液为0.05M的碳酸盐缓冲液，pH为9.6。

6.根据权利要求1所述的一种肺炎克雷伯菌抗体ELISA快速检测试剂盒，其特征在于，所述酶标二抗为兔抗貂IgG-HRP酶标抗体。

7.根据权利要求1所述的一种肺炎克雷伯菌抗体ELISA快速检测试剂盒，其特征在于，所述底物显色液为可溶型单组分TMB四甲基联苯胺底物溶液。

8.根据权利要求1所述的一种肺炎克雷伯菌抗体ELISA快速检测试剂盒，其特征在于，所述终止液为2M的H₂SO₄。

9.采用权利要求1至8中任意一项所述的试剂盒实现的一种肺炎克雷伯菌抗体ELISA快速检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一、抗原包被

用包被缓冲液将病原菌稀释成浓度为10⁷～10⁹cfu/mL的病原菌液；设被检样品孔、阴性对照孔和空白对照孔，被检样品孔和阴性对照孔内分别加入上述病原菌液，加入量为50～150μL/孔，空白对照孔内加入包被缓冲液进行包被，加入量为100～300μL/孔；

步骤二、洗板

每个酶标板孔内加入100～300μLPBST洗涤缓冲液，静置3～5min，甩去洗液，在吸水纸上拍干，重复3～5次；

步骤三、封闭

每个酶标板孔内加入100～300μLBSA封闭液，封闭30～120min；空白对照孔不加任何试剂；

步骤四、洗板

重复步骤二；

步骤五、加一抗阳性血清

用样品稀释液将一抗阳性血清按1:(100～1000)倍稀释；被检样品孔加入一抗阳性血清，阴性对照孔加入阴性对照血清，加入量均为50～150μL/孔，37℃孵育30～90min；空白对照孔不加任何试剂；

步骤六、洗板

重复步骤二；

步骤七、加酶标二抗

用样品稀释液将酶标二抗按1:(2500～7500)倍稀释；每个酶标板孔内加入50～150μL的酶标二抗，37℃孵育30～90min；

步骤八、洗板

重复步骤二；

步骤九、加底物

每个酶标板孔内加入50～150μL底物显色液，37℃避光反应5～20min；

步骤十、终止反应

每个酶标板孔内加入50μL终止液；

步骤十一、结果判断

在酶标仪中读取D_450nm处的吸光度值；当被检样品的OD₄₅₀值＞X+3SD时，判定为阳性；当被检样品的OD₄₅₀值＜X+2SD时，判定为阴性；介于两者之间判定为可疑；X为吸光度值的平均值，SD为标准方差。