[发明专利]联合MSLN单链抗体和CCL19杀伤胃癌细胞的CAR载体及其构建方法和应用

权利要求书

1.联合MSLN单链抗体和CCL19杀伤胃癌细胞的CAR载体，其特征在于，包括嵌合抗原受体和载体，所述嵌合抗原受体连接在所述载体上，

所述嵌合抗原受体包括两种特异性结构分别为：MSLN单链抗体和趋化因子CCL19，所述MSLN单链抗体的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述趋化因子CCL19的核苷酸序列如SEQID NO.8所示。

2.根据权利要求1所述的联合MSLN单链抗体和CCL19杀伤胃癌细胞的CAR载体，其特征在于，所述嵌合抗原受体的结构组成为CD8leader-MSLN scFv-CD8α-CD28-CD137-CD3ζ-IRES-CCL19。

3.根据权利要求2所述的联合MSLN单链抗体和CCL19杀伤胃癌细胞的CAR载体，其特征在于，所述CD8leader可表达引导新合成的蛋白质进行跨膜转移的引导肽，所述CD8leader的核苷酸序列SEQ ID NO.1所示，

所述MSLN scFv表示MSLN单链抗体，

所述CD8α为跨膜区，连接胞外抗原结合域和胞内信号域，且核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，

所述CD28-CD137为共刺激结构域，所述CD28核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述CD137核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，

所述CD3ζ为信号转导域，核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；

所述IRES为核糖体识别位点，是实现同一载体高效共表达两个基因的元件，核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；

所述CCL19表示趋化因子CCL19。

4.根据权利要求1所述的联合MSLN单链抗体和CCL19杀伤胃癌细胞的CAR载体，其特征在于，所述载体包括PUC19质粒、慢病毒载体。

5.根据权利要求4所述的联合MSLN单链抗体和CCL19杀伤胃癌细胞的CAR载体，其特征在于，所述慢病毒载体为pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro。

6.联合MSLN单链抗体和CCL19杀伤胃癌细胞的CAR载体的构建方法用于构建如权利要求1-5任一项所述的联合MSLN单链抗体和CCL19杀伤胃癌细胞的CAR载体的方法，其特征在于，所述构建方法的步骤如下：

(1)将所述嵌合抗原受体保存在所述PUC19质粒上；

(2)将含有步骤(1)中PUC19质粒和所述慢病毒载体进行双酶切，将酶切产物分别经过琼脂糖凝胶电泳分离，获得双酶切后的含有所述嵌合抗原受体的目的片段和双酶切后慢病毒载体，

(3)将步骤(2)中的含有所述嵌合抗原受体的目的片段和步骤(2)中的慢病毒载体进行连接，将连接产物进行转化，提取质粒，获得含有嵌合抗原受体结构的重组质粒，所述重组质粒为联合MSLN单链抗体和CCL19杀伤胃癌细胞的CAR载体。

7.根据权利要求6所述的联合MSLN单链抗体和CCL19杀伤胃癌细胞的CAR载体的构建方法，其特征在于，所述步骤(2)中的双酶切位点为EcoRI和NotI，所述(3)中含有所述嵌合抗原受体的目的片段和慢病毒载体连接的摩尔比为5:1。

8.联合MSLN单链抗体和CCL19杀伤胃癌细胞的CAR载体的应用，基于权利要求1-5任一项所述方法构建的联合MSLN单链抗体和CCL19杀伤胃癌细胞的CAR载体，其特征在于：将联合MSLN单链抗体和CCL19杀伤胃癌细胞的CAR载体进行慢病毒包装，获得病毒颗粒，经离心浓缩后获得高滴度的慢病毒悬液，所述慢病毒悬液用于感染T细胞，获得CAR-T细胞，所述CAR-T细胞通过识别特异性蛋白MSLN靶向杀伤胃癌细胞。

9.根据权利要求8所述的联合MSLN单链抗体和CCL19杀伤胃癌细胞的CAR载体的应用，其特征在于，所述慢病毒包装采用三质粒包装系统，所述三质粒包装系统包括PSPAX2质粒、pMD2G质粒和所述联合MSLN单链抗体和CCL19杀伤胃癌细胞的CAR载体，所述PSPAX2质粒、所述pMD2G质粒、所述联合MSLN单链抗体和CCL19杀伤胃癌细胞的CAR载体的比例为27:3:20，所述慢病毒包装采用293T细胞作为慢病毒的包装细胞。