[发明专利]联合MSLN单链抗体和CCL19杀伤胃癌细胞的CAR载体及其构建方法和应用

说明书

本发明属于医药生物领域，具体涉及联合MSLN单链抗体和CCL19杀伤胃癌细胞的CAR载体及其构建方法和应用。该CAR载体包括MSLN单链抗体和趋化因子CCL19，CAR结构为CD8leader‑MSLN scfv‑CD8α‑CD28‑CD137‑CD3ζ‑IRES‑CCL19，以病毒感染方式获得含有该治疗载体的T细胞，即CAR‑T细胞(Chimeric Antigen Receptor T‑Cell)，通过表达CAR结构，靶向识别和杀伤MSLN阳性表达的胃癌细胞。趋化因子CCL19趋化T细胞浸润肿瘤组织，使CAR‑T细胞表现出更强的肿瘤细胞杀伤能力。

技术领域

本发明属于医药生物领域，具体涉及联合MSLN单链抗体和CCL19杀伤胃癌细胞的CAR载体及其构建方法和应用。

背景技术

胃癌是我国目前临床比较常见的恶性肿瘤之一，具有高发病率和高死亡率的特点，在我国，胃癌的发病率和死亡率占恶性肿瘤的第三位。目前，胃癌的治疗方式主要有手术治疗、放疗、化疗、靶向治疗、免疫治疗。手术是唯一可能治愈胃癌的方式，但进展期胃癌的单纯手术治疗可能会存在肉眼或镜下残留灶，使复发转移率大大增加；放化疗毒副作用大，疗效也不能达到满意效果；因此新的治疗方法亟待提出。

LAK细胞、DC、CIK细胞都曾作为肿瘤的免疫治疗手段，但是以上各种治疗方法均缺乏特异性识别肿瘤相关抗原(tumor associated antigen，TAA)和杀伤特定肿瘤靶细胞的能力；而肿瘤免疫编辑的过程又会使靶细胞表面的主要组织相容性复合物(mainhistocompatibility complex，MHC)在肿瘤细胞表面表达下降，形成免疫逃逸，使肿瘤细胞可成功躲避T细胞攻击。

嵌合抗原受体(CAR)-T细胞疗法是通过基因工程技术在T细胞表面人为过表达能识别特定的肿瘤表面抗原的单链抗体可变区基因片段，从而使T细胞识别特定抗原、杀伤表达该抗原的靶细胞。同时，由于CAR-T细胞是采用抗体识别抗原模式，因此不受MHC的限制。

间皮素(MSLN)是一种存在于细胞表面的锚定糖蛋白，因其在正常组织中不表达或间皮组织中低表达，但在30％的肿瘤中高表达，如卵巢癌、胃癌、结肠癌等实体瘤，而成为备受关注的肿瘤细胞特异性靶向抗原。

趋化因子的主要作用是趋化细胞的迁移，细胞沿着趋化因子浓度增加的信号向趋化因子源处的迁徙。有些趋化因子在免疫监视过程中控制免疫细胞趋化，如诱导淋巴细胞到淋巴结。这些淋巴结中的趋化因子通过与这些组织中的抗原提呈细胞相互作用而监视病原体的入侵。这些被称为稳态趋化因子，其产生无需刺激而分泌。人趋化因子c-c-基元配体19(CCL19)是趋化因子CC家族成员，其体外被证实可以通过CCL19/CCR7途径下调β-catenin蛋白表达，而β-catenin蛋白为一种经典的促癌蛋白，由此，可以推测CCL19可以直接作用于肿瘤细胞。

由此，如何有效避免免疫逃逸的发生，增强T淋巴细胞对胃癌细胞的杀伤，从而提高CAR-T免疫疗法抗胃癌的效果，成为CAR-T治疗的一个技术难题。

发明内容

本发明目的是为了解决上述问题，本发明提供了能靶向MSLN并联合趋化因子CCL19杀伤胃癌细胞的CAR载体。本发明针对胃癌细胞特异性蛋白MSLN，有效避免肿瘤免疫逃逸；通过趋化因子CCL19增强T淋巴细胞对胃癌细胞的杀伤，从而提高CAR-T免疫疗法抗胃癌的效果。此外，还包括联合MSLN单链抗体和趋化因子CCL19杀伤胃癌细胞的CAR载体的构建方法及其应用。

本发明提供的联合MSLN单链抗体和CCL19杀伤胃癌细胞的CAR载体具体技术方案如下：

联合MSLN单链抗体和CCL19杀伤胃癌细胞的CAR载体，包括嵌合抗原受体和载体，所述嵌合抗原受体连接在所述载体上，所述嵌合抗原受体包括两种特异性结构分别为：MSLN单链抗体和趋化因子CCL19，所述MSLN单链抗体的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述趋化因子CCL19的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。