[发明专利]一种检测蛋白-蒜酶偶联物的靶向性的方法

权利要求书

1.一种检测蛋白-蒜酶偶联物的靶向性的方法，包括以下步骤:

1)将蛋白-蒜酶偶联物中蛋白的特异性抗体固定于硝酸纤维素膜上，得到免疫层析试纸条；

所述固定的方式为喷涂固定或点样划线固定；所述蛋白的特异性抗体的浓度为1mg/mL；所述蛋白的特异性抗体的固定量为0.5μL；

2)将蛋白-蒜酶偶联物作为待测样品在步骤1)所述免疫层析试纸条上加样，进行免疫层析，测定试纸条荧光强度，当最大荧光强度≥350时，说明蛋白-蒜酶偶联物具有靶向性；当荧光强度＜350时，说明蛋白-蒜酶偶联物不具有靶向性；

所述蛋白-蒜酶偶联物的点样量为60μL；

350为空白异硫氰酸荧光素最大荧光强度；

所述荧光分光光度计的激发波长为490nm；所述荧光分光光度计的发射波长为505～600nm；所述发射波长的狭缝宽度为(2.5,2.5)；

所述蛋白-蒜酶偶联物的制备方法，包括以下步骤:

a)将蒜酶和碳酸盐缓冲液混合，离心，得到蒜酶上清液；

b)将异硫氰酸荧光素和碳酸盐缓冲液混合，得到异硫氰酸荧光素溶液；

c)将步骤a)中所述蒜酶上清液与步骤b)中所述异硫氰酸荧光素溶液混合，进行蒜酶的荧光标记反应，得到蒜酶荧光标记物；

d)将蛋白和磷酸盐缓冲液混合，得到蛋白溶液；

e)将步骤d)所述蛋白溶液、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基硫代琥珀酰亚胺混合，超滤离心，得到超滤溶液；

f)将步骤e)所述超滤溶液与步骤c)所述蒜酶荧光标记物混合，进行偶联反应，得到蛋白-蒜酶偶联物；

所述步骤a)与b)之间无时间顺序限定。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述蛋白为牛血清白蛋白。

3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤c)中所述荧光标记反应避光进行。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤c)中所述荧光标记反应的温度为1～5℃；所述荧光标记反应的时间为10～14h。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤c)中所述蒜酶上清液与异硫氰酸荧光素溶液的体积比为3～5:0.5～1.5。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤e)中所述蛋白溶液、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和异硫氰酸荧光素溶液的比例为0.5～1.5mL:190～210mg:14～16mg。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤f)中所述超滤溶液与蒜酶荧光标记物的体积比为0.5～1.5:0.5～1.5。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤e)中所述超滤离心的截留分子量为9～11KDa；所述超滤离心的转速为4000～6000rpm，所述超滤离心的时间为15～25min。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤f)中所述偶联反应的温度为16～25℃；所述偶联反应的时间为2～4h。