[发明专利]一种检测蛋白-蒜酶偶联物的靶向性的方法

说明书

本发明提供了一种检测蛋白‑蒜酶偶联物的靶向性的方法，属于免疫层析技术领域，所述方法包括以下步骤:将蛋白特异性抗体固定于纤维素膜上，经层析后蛋白抗体捕获具有荧光的蛋白‑蒜酶偶联物，最后检测试纸条荧光强度；当最大荧光强度≥350时，说明蛋白‑蒜酶偶联物具有靶向性；当最大荧光强度＜350时，说明蛋白‑蒜酶偶联物不具有靶向性。本发明的方法利用免疫层析技术对蛋白‑蒜酶偶联物的靶向性进行检测，具有耗时短，成本低且操作简单等优点。

技术领域

本发明涉及免疫层析技术领域，尤其涉及一种检测蛋白-蒜酶偶联物的靶向性的方法。

背景技术

抗体偶联药物(Antibody-Drug Conjugate，ADC)作为一种新型的生物导弹，实现了单抗靶向作用和小分子药物细胞毒性的强强联合，现已成为肿瘤靶向治疗发展最快的领域之一。

大蒜是多年生百合科葱属植物蒜(Allium sativum L.)的地下鳞茎，是历史悠久的药食两用植物。大蒜含有多种化学成分，而含硫有机化合物是其重要的活性物质，主要包括蒜氨酸和大蒜辣素。大蒜辣素是大蒜被粉碎后生成的一个含氧硫化物，蒜氨酸与蒜酶(蒜氨酸裂解酶，Alliinase)分处大蒜细胞的不同部位，大蒜经粉碎后，蒜氨酸与蒜酶相遇，快速反应产生大蒜辣素。近年来，国内外许多学者致力于大蒜的研究，证实大蒜具有多方面的生物活性。其中大蒜辣素在大蒜的抗菌活性中起着重要作用，大蒜辣素的抗肿瘤活性，其机理在于通过抑制肿瘤细胞的增殖，影响细胞周期，诱导肿瘤细胞凋亡，对抗癌药具有增敏作用等，诱导肿瘤细胞的凋亡和抑制或杀死肿瘤细胞。但由于大蒜辣素不稳定，成药困难，所以现有研究采用蒜氨酸与蒜酶联用，在肿瘤细胞原位释放大蒜辣素，从而产生杀伤肿瘤细胞的作用。

对于抗体药物偶联物，一般采用体内动物试验，进行造模，给药后采用活体成像技术或对动物组织进行细胞分子方面的研究对偶联物的靶向性和活性进行研究，此过程不仅耗时长，且成本高，所使用的仪器昂贵，并且存在动物试验伦理学问题；在体外细胞试验筛选抗体药物偶联物时，对试验环境要求高，操作复杂且成本高。所以寻找一种简单快捷方法对偶联物靶向性进行初步确定十分必要。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测蛋白-蒜酶偶联物的靶向性的方法，该方法能够快速检测蛋白-蒜酶偶联物的靶向性。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案:

本发明提供了一种检测蛋白-蒜酶偶联物的靶向性的方法，包括以下步骤:

1)将蛋白-蒜酶偶联物中蛋白的特异性抗体固定于硝酸纤维素膜上，得到免疫层析试纸条；

2)将蛋白-蒜酶偶联物作为待测样品在步骤1)所述免疫层析试纸条上加样，进行免疫层析，测定试纸条荧光强度，当最大荧光强度≥350时，说明蛋白-蒜酶偶联物具有靶向性；当最大荧光强度＜350时，说明蛋白-蒜酶偶联物不具有靶向性。

优选的，所述蛋白为牛血清白蛋白。

优选的，所述蛋白-蒜酶偶联物的制备方法包括以下步骤:

a)将蒜酶和碳酸盐缓冲液混合，离心，得到蒜酶上清液；

b)将异硫氰酸荧光素和碳酸盐缓冲液混合，得到异硫氰酸荧光素溶液；

c)将步骤a)中所述蒜酶上清液与步骤b)中所述异硫氰酸荧光素溶液混合，进行蒜酶的荧光标记反应，得到蒜酶荧光标记物；

d)将蛋白和磷酸盐缓冲液混合，得到蛋白溶液；

e)将步骤d)所述蛋白溶液、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基硫代琥珀酰亚胺混合，超滤离心，得到超滤溶液；

f)将步骤e)所述超滤溶液与步骤c)所述蒜酶荧光标记物混合，进行偶联反应，得到蛋白-蒜酶偶联物；