[发明专利]一种成熟脂肪细胞中自噬相关蛋白乙酰化位点研究方法

权利要求书

1.一种成熟脂肪细胞中自噬相关蛋白乙酰化位点研究方法，其特征在于：包括如下步骤：

步骤Ⅰ、确定自噬相关蛋白A存在乙酰化修饰

先进行培养脂肪细胞，并诱导其分化为成熟脂肪细胞，后给予去乙酰化酶抑制剂处理，最后采用免疫沉淀的方法确定蛋白A存在乙酰化修饰；

步骤Ⅱ、质谱分析或软件预测蛋白A可能的乙酰化位点

步骤Ⅲ、乙酰化位点鉴定

工具细胞：用293T细胞进行乙酰化位点鉴定，构建乙酰化位点突变的质粒，转染293T细胞，采用免疫沉淀的方法观察位点突变后蛋白A的乙酰化水平变化；

成熟脂肪细胞：构建乙酰化位点突变的慢病毒，感染成熟脂肪细胞，采用免疫沉淀的方法观察位点突变后蛋白A的乙酰化水平变化；

步骤Ⅳ、乙酰化位点功能研究

自噬相关蛋白A的功能是研究其对自噬的影响，后续对各条通路针对不同动物模型、疾病具体进行研究；

自噬相关蛋白A的过表达慢病毒和乙酰化位点突变的过表达慢病毒分别感染成熟脂肪细胞；

透射电镜观察自噬小体的变化；

同时感染GFP-LC3慢病毒，共聚焦荧光显微镜观察GFP-LC3点状聚集的情况；

Western blot检测自噬标志蛋白LC3的表达变化；

给予羟氯喹处理后，再次通过Western blot检测自噬标志蛋白LC3的表达变化，即是利用自噬通量的方法检测对自噬的影响。

2.根据权利要求1所述的一种成熟脂肪细胞中自噬相关蛋白乙酰化位点研究方法，其特征在于：所述脂肪细胞采用3T3-L1细胞系。

3.根据权利要求1所述的一种成熟脂肪细胞中自噬相关蛋白乙酰化位点研究方法，其特征在于：所述乙酰化酶抑制剂采用尼克酰胺(NAM)和制滴菌素A(TSA)。

4.根据权利要求1所述的一种成熟脂肪细胞中自噬相关蛋白乙酰化位点研究方法，其特征在于：所述免疫沉淀法是采用蛋白A的抗体将经乙酰化酶抑制剂处理后的成熟脂肪细胞进行沉淀，并用通用乙酰化抗体进行杂交以确定蛋白A存在乙酰化修饰。

5.根据权利要求1所述的一种成熟脂肪细胞中自噬相关蛋白乙酰化位点研究方法，其特征在于：所述蛋白A可能的乙酰化位点在进行预测时，从UniProt、CPLM和NCBI蛋白质数据库中收集原核生物蛋白质乙酰化数据作为参照。

6.根据权利要求1所述的一种成熟脂肪细胞中自噬相关蛋白乙酰化位点研究方法，其特征在于：所述软件预测是采用MATLAB软件和C#编程语言的预测软件平台ProAcePred，且所述预测软件平台ProAcePred在用户提交至少一条原核蛋白质序列，即可自动给出其蛋白质潜在的乙酰化位点信息，实现对蛋白A乙酰化位点的高通量预测。

7.根据权利要求1所述的一种成熟脂肪细胞中自噬相关蛋白乙酰化位点研究方法，其特征在于：所述质谱分析是利用开源免费软件ProteoWizard将质谱采集的原始数据转化为可视化的mgf格式的数据。