[发明专利]一种成熟脂肪细胞中自噬相关蛋白乙酰化位点研究方法

说明书

本发明公开了一种成熟脂肪细胞中自噬相关蛋白乙酰化位点研究方法，涉及酒配方技术领域，其包括如下步骤：步骤Ⅰ、确定自噬相关蛋白A存在乙酰化修饰，先进行培养脂肪细胞，并诱导其分化为成熟脂肪细胞，后给予去乙酰化酶抑制剂处理。该成熟脂肪细胞中自噬相关蛋白乙酰化位点研究方法，在预测的基础上进行乙酰化位点鉴定并得出乙酰化修饰点的具体位置，通过对乙酰化修饰位点重新定位与评估，使乙酰化修饰位点的鉴定更准确、更可信，因而可极大地提高检索结果的可信度，随后又进行乙酰化位点功能研究，且研究过程是采用病毒感染的方式，因而可在一定程度上缩短研究实验所消耗的时间，方法可靠，具有良好的重复性。

技术领域

本发明涉及酒配方技术领域，具体为一种成熟脂肪细胞中自噬相关蛋白乙酰化位点研究方法。

背景技术

蛋白质乙酰化是在乙酰基转移酶的作用下，在蛋白质赖氨酸残基上添加乙酰基的过程，是细胞控制基因表达，蛋白质活性或生理过程的一种机制。

乙酰化是保障蛋白质活性所必须的且具有高度调控作用的蛋白质翻译后修饰，它能发生在核心组蛋白、将近40种转录因子和30多种其他蛋白质靶标中，从细菌到人类，蛋白质乙酰化不仅对细胞核功能发挥起关键作用，而且对各种胞质代谢也具有重要调控作用，包括细胞骨架动力学、能量代谢、内吞作用和自体吞噬，甚至包含跨膜信号的传导，对于乙酰化位点的识别将是理解乙酰化分子机制的基础。

对脂肪细胞中自噬相关蛋白乙酰化位点研究在生物学中具有重要意义，是人类对生命认知的进一步体现，因而生物学界逐渐出现了多种关于脂肪细胞中自噬相关蛋白乙酰化位点研究方法，然而，目前脂肪细胞中自噬相关蛋白乙酰化位点研究方法大多是直接对脂肪细胞进行染色处理，再通过显微镜等设备进行观察，不仅未进行判断脂肪细胞中是否存在乙酰化修饰，同时也未进行乙酰化位点的预测，导致蛋白乙酰化位点的研究过程中过于盲目，容易浪费掉研究人员的宝贵时间，同时还降低了实验结果的可信度，因此亟需一种成熟脂肪细胞中自噬相关蛋白乙酰化位点研究方法来解决上述问题。

发明内容

(一)解决的技术问题

针对现有技术的不足，本发明提供了一种成熟脂肪细胞中自噬相关蛋白乙酰化位点研究方法，解决了目前脂肪细胞中自噬相关蛋白乙酰化位点研究方法大多是直接对脂肪细胞进行染色处理，再通过显微镜等设备进行观察，不仅未进行判断脂肪细胞中是否存在乙酰化修饰，同时也未进行乙酰化位点的预测，导致蛋白乙酰化位点的研究过程中过于盲目，容易浪费掉研究人员的宝贵时间，同时还降低了实验结果可信度的问题。

(二)技术方案

为达到以上目的，本发明采取的技术方案是：一种成熟脂肪细胞中自噬相关蛋白乙酰化位点研究方法，包括如下步骤：

步骤Ⅰ、确定自噬相关蛋白A存在乙酰化修饰

先进行培养脂肪细胞，并诱导其分化为成熟脂肪细胞，后给予去乙酰化酶抑制剂处理，最后采用免疫沉淀的方法确定蛋白A存在乙酰化修饰。

步骤Ⅱ、质谱分析或软件预测蛋白A可能的乙酰化位点

步骤Ⅲ、乙酰化位点鉴定

工具细胞：用293T细胞进行乙酰化位点鉴定，构建乙酰化位点突变的质粒，转染293T细胞，采用免疫沉淀的方法观察位点突变后蛋白A的乙酰化水平变化。

成熟脂肪细胞：构建乙酰化位点突变的慢病毒，感染成熟脂肪细胞，采用免疫沉淀的方法观察位点突变后蛋白A的乙酰化水平变化。

步骤Ⅳ、乙酰化位点功能研究

自噬相关蛋白A的功能是研究其对自噬的影响，后续对各条通路针对不同动物模型、疾病具体进行研究。

自噬相关蛋白A的过表达慢病毒和乙酰化位点突变的过表达慢病毒分别感染成熟脂肪细胞。

透射电镜观察自噬小体的变化。