[发明专利]一种用于判别和校准高通量测序污染的内标及其应用

说明书

本发明提供了一种用于判别和校准高通量测序污染的内标以及使用该内标判别和校准高通量测序污染的方法。本发明的内标是长度在几十到几百个碱基或碱基对的DNA或RNA片段，每一个样本对应不同的内标。本发明的内标不仅能精确而可靠的判别和校准高通量测序中的污染，还可以用作测序时的碱基平衡以及用于跟踪PCR及测序过程中的错误率。

技术领域

本发明属于高通量测序领域，具体地，属于体外诊断技术领域，涉及一种用于判别和校准高通量测序污染的内标以及使用该内标判别和校准高通量测序污染的方法，以及其他各种用途。

背景技术

高通量测序(NGS)能一次并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定，可逆末端终止测序，半导体测序，焦磷酸测序等都属于高通量测序。

高通量测序的基础是构建样本的测序文库。根据测序的对象，分为DNA文库和RNA文库，DNA文库包括但不限于全基因组文库、全外显子组文库、靶向DNA文库；RNA的cDNA文库包括但不限于总RNA文库、全转录组文库、小RNA文库、非编码RNA文库、靶向RNA文库。根据文库构建方法，分成扩增法构建文库如PCR文库制备，连接法构建文库如truseq法文库构建，转座子法构建文库如nextera法文库制备，浓缩法构建文库如Enrichment法文库制备等；无论是那种测序对象、哪种文库构建方法，在构建测序文库时都需要用到测序接头(adapter，负责将需要测序的序列连接在测序芯片上。其一端与测序芯片上锚定的序列互补，另一端根据需要设计，如与引物、index互补)、引物(负责扩增样本，构建测序文库)；多样本混合测序时则都需要用到样本标签(barcode或index，index专指6-8个碱基的样本身份识别序列，本文统一使用index)。测序接头(adapter)起到桥接作用，其序列的一头通过碱基识别被固定在测序芯片上，另一头则根据需要及实验步骤接上了index、引物和目标序列；引物则根据不同文库的需要设计，如全基因组文库通用引物，全外显子组文库通用引物，RNA转化成cDNA文库后的通用引物，靶向测序引物等等；样本标签的作用是多个样本混合在一个反应池中测序时，区分每个样本。

由于高通量测序的单位成本比较高，如果每个样本要测的序列比较少，通常将多个样本混合成一个“测序样本”，大大节约测序成本。这就需要用到样本标签(index)来区分每个样本。每个样本都含有至少1个特异性的样本标签，如果样本太多标签不够，也可以采用样本片段两头各1个标签的组合来决定标签的唯一性。

然而，在大量样本混合测序的实际应用的过程中，本发明发现，样本和样本之间、标签和标签之间可能形成相互污染，例如：在样本核酸提取过程中造成的样本相互污染，在标签合成、纯化、使用过程中造成的标签相互污染。根据近几年高通量测序业务实际测试情况来看，样本核酸提取过程中的污染率达到0-50％；标签合成和纯化过程中的污染率达到1-2％，使用过程中的污染率达到0-20％。以上高通量测序业务均在条件合格的GMP实验室进行，科研环境中污染可能更甚。

问题造成的后果：

在把样本混合进行测序时，样本或标签相互污染可能造成样本检测结果的误读。通常污染的量占单个样本的总量比较小，如果用于胚系基因测序，基本没有影响；然而，当将高通量测序技术应用于体细胞突变、罕见低频突变，如肿瘤突变检测、病毒诱导的体细胞突变时，就变得非常棘手：一是在突变早期，突变的细胞只占机体正常细胞的极少数，这时候就无法区分是突变还是样本或标签之间的污染造成的样本误读；二是病理组织本身，特别是肿瘤组织本身就在不断形成新的突变，每种突变占到病理组织细胞总量的极少数，如果样本或标签之间相互污染，也给突变的解读造成了无法排除的干扰。

随着医学的发展，采用高通量测序来检测肿瘤的突变，根据突变结果制定治疗方案和用药建议，已经成为主流趋势，目前我国已陆续有多个肿瘤突变高通量测序试剂盒获批。高通量测序的污染问题正亟待控制和规范。

发明内容