[发明专利]抗HSA单域抗体及其融合蛋白的亲和层析纯化方法

说明书

本发明属于蛋白纯化领域，尤其涉及一种抗人血清白蛋白(HSA)单域抗体及其融合蛋白的亲和层析纯化方法。其包括：将HSA与亲和介质混合，偶联反应，制得HSA亲和层析介质；将待纯化的样品通过预先用平衡缓冲液平衡好的HSA亲和层析介质；然后用清洗缓冲液清洗结合了样品的亲和层析介质；再用洗脱缓冲液将抗HSA单域抗体或其融合蛋白从层析介质上洗脱，收集洗脱峰得到洗脱样品；最后用中和缓冲液调节洗脱样品至中性即得。本发明方法获得的抗HSA单域抗体及其融合蛋白的纯度达95％以上，且能让此类单域抗体及其融合蛋白保持良好的成药性及稳定性。

技术领域

本发明属于蛋白纯化领域，尤其涉及到一种抗HSA单域抗体及其融合蛋白的亲和层析纯化方法。

背景技术

人血清白蛋白(HSA)作为人体血液中最大单一组分蛋白，以其长达20天的半衰期及无酶学和免疫学活性，近年来被广泛应用于改善蛋白质药物长效的载体。但随着血清白蛋白融合技术研究的深入，出现一系列融合蛋白产量低、稳定性差、本身分子量大进而影响融合蛋白的生物活性等不足之处。在蛋白工程技术飞速发展的今天，寻求更合适的蛋白质长效平台载体成为趋势。

抗HSA单域抗体除具有一般单域抗体的高亲和、热稳定性好、分子量小、特异性强等优点外，还具有与HSA结合后延长蛋白质半衰期、不影响融合蛋白空间组位及生物学活性等优势，以其作为长效蛋白质平台载体，具有良好、广阔的应用前景。目前常规用于延长靶标蛋白半衰期的技术手段有PEG修饰、Fc融合、HSA融合、其它大分子蛋白或蛋白伴侣融合等。这些方法虽然在一定程度上延长了靶标蛋白在机体内的稳定性，但各自的缺点也尤为突出，比如PEG修饰会因为修饰程度不同，而带来分子均一性很差，且修饰后分子量偏大；Fc融合会因为Fc自身的糖基化修饰、Fc介导细胞毒及补体激活作用、Fc可能影响靶标蛋白活性、二聚体存在形式等，带来一系列分子量偏大、毒副作用、活性降低等问题；HSA融合会降低靶标蛋白活性、HSA在发酵过程中会出现降解和聚合现象，进而带来靶标蛋白生物活性降低、分子量偏大、融合蛋白样品稳定性差、毒副作用等缺点；其它大分子蛋白或蛋白伴侣也存在影响靶标蛋白生物活性、稳定性差等缺点。而采用与抗HSA的单域抗体进行融合，不仅可以通过抗HSA单域抗体与HSA结合来延长靶标蛋白半衰期；而且该单域抗体分子量较小，融合后不会使融合蛋白分子偏大、样品稳定性好、也不会影响靶标蛋白的生物活性、更不会带来毒副作用；再者该单域抗体融合蛋白可选择的表达体系更宽，生产更容易。

现有的常规抗HSA单域抗体融合蛋白的纯化过程依赖于标签肽段，通常通过添加组氨酸标签以利于后期用镍柱亲和层析纯化抗HSA单域抗体融合蛋白。但标签肽段的存在不仅标签自身会影响抗HSA单域抗体融合蛋白的成药性，而且在纯化过程中会引入Ni等重金属，增加工艺及分析的难度，更加影响抗体融合蛋白的成药性，限制了此类蛋白的应用；而无标签蛋白的纯化需经多步纯化才能实现，整个纯化实验操作周期会延长，这样不仅对蛋白本身理化稳定性有一定的挑战，且最终得率低，增加工艺的复杂性和生产成本。因此寻找一种专一性好，产品纯度高，样品吸附量大，且不影响单域抗体融合蛋白成药性的纯化方法是目前本领域中迫切需要解决的问题。基于此，我们开发了一种以HSA为配基的亲和层析介质，改进了纯化工艺，并将其应用于抗HSA单域抗体及其融合蛋白的纯化制备，取得了很好的效果。

发明内容

本发明针对现有技术中存在的问题，提供一种抗HSA单域抗体及其融合蛋白的亲和层析纯化方法，该纯化方法以HSA为配基，利用HSA-抗HSA单域抗体特异性结合进行亲和层析，摆脱了对其他纯化标签的依赖，及非标签蛋白纯化带来的困难，改进了纯化工艺，显著提高了蛋白的纯度，且保证了此类单域抗体及其融合蛋白的成药性以及在亲和层析过程中的稳定性。

如本文所用，除非特别指出，则“约”是指±10％范围内。

具体而言，本发明中的抗HSA单域抗体及其融合蛋白的亲和层析纯化方法，包括以下步骤：

步骤1，亲和层析介质的制备：

(1)活化：以活化缓冲液洗涤活化亲和介质；