[发明专利]一种基于CRISPR-Cas9技术的基因编辑系统及应用

权利要求书

1.一种基于CRISPR-Cas9技术的基因编辑系统，其特征在于，所述系统为内源U6启动子依赖型，包括表达载体和拯救载体；

所述表达载体包括抗药筛选标记、sgRNA表达盒和Cas9表达盒，所述Cas9表达盒包括负筛标记；

所述拯救载体包括同源臂插入位点和外源基因片段插入位点。

2.根据权利要求1所述的系统，其特征在于，所述抗药筛选标记包括HDHFR、BSD、NEO、PAC或YDHODH中的任意一种或至少两种的组合，优选为BSD；

优选地，所述负筛选标记包括yFCU和/或HSV-TK，优选为yFCU。

3.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包含权利要求1或2所述的系统；

优选地，所述宿主细胞包括恶性疟原虫、间日疟原虫、诺氏疟原虫、三日疟原虫或卵形疟原虫的中任意一种或至少两种的组合，优选为恶性疟原虫。

4.一种疟原虫基因编辑的方法，采用如权利要求1或2所述的系统，其特征在于，包括如下步骤：

(1)构建权利要求1或2所述的表达载体和拯救载体；

(2)根据目的基因筛选靶点序列并连接至表达载体中；

(3)将外源基因和来源于目的基因的同源臂克隆至拯救载体上；

(4)将步骤(2)的表达载体和步骤(3)的拯救载体制备成DNA-loaded RBC；

(5)将疟原虫裂殖体加入步骤(4)制备的DNA-loaded RBC中；

(6)进行抗药筛选和负筛，获得重组疟原虫；

(7)对步骤(6)获得的重组疟原虫进行单克隆化，将不同单克隆进行表达载体残留检测和药物敏感性测试；

(8)按照步骤(1)-(6)的操作方法，使用同一药筛标记对疟原虫进行再次基因编辑。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述疟原虫包括恶性疟原虫虫株Pf3D7、PfNF54、PfFCR3或PfDd2中的任意一种或至少两种的组合，优选为Pf3D7；

优选地，步骤(2)所述目的基因包括红内期非必须基因Pf47或P230P，优选为红内期非必须基因Pf47。

6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述外源基因包括R787OD和/或抗原蛋白基因，优选为R787OD。

7.根据权利要求4-6中任一项所述的方法，其特征在于，步骤(4)所述制备DNA-loadedRBC的方法为：将载体在大肠杆菌中复制后提取纯化，电转至人红细胞，制备得到DNA-loaded RBC；

优选地，步骤(5)所述裂殖体的制备方法为：对体外培养的Pf3D7虫株进行明胶富集，获得裂殖体。

8.根据权利要求4-7中任一项所述的方法，其特征在于，具体包括如下步骤：

(1)构建权利要求1或2所述的表达载体和拯救载体；

(2)根据目的基因Pf47筛选靶点序列并连接至表达载体中；

(3)将外源基因R787OD和来源于目的基因Pf47的同源臂克隆至拯救载体上；

(4)将步骤(2)的表达载体和步骤(3)的拯救载体在大肠杆菌中复制后提取纯化，电转至人红细胞，制备成DNA-loaded RBC；

(5)对体外培养的Pf3D7虫株进行明胶富集，获得裂殖体，将裂殖体加入步骤(4)制备的DNA-loaded RBC中；

(6)进行抗药筛选并进行PCR测序鉴定和外源基因表达分析，再进行负筛选；

(7)对步骤(6)获得的重组疟原虫进行单克隆化，将不同单克隆进行表达载体残留检测和药物敏感性测试；

(8)按照步骤(1)-(6)的操作方法，使用同一药筛标记对疟原虫进行再次基因编辑。

9.一种采用权利要求4-8中任一项所述方法制备得到的重组疟原虫。

10.一种如权利要求1或2所述的系统、权利要求3所述的宿主细胞、权利要求4-8中任一项所述的方法或权利要求9所述的重组疟原虫用于疟原虫基因大片段敲入和/或设计肿瘤疫苗的应用。