[发明专利]一种基于CRISPR-Cas9技术的基因编辑系统及应用

说明书

本发明提供了一种基于CRISPR‑Cas9技术的基因编辑系统及其应用，以内源U6启动子依赖型载体系统为基础，在表达载体的Cas9表达盒内加入负筛选标记，并将包含同源臂的拯救载体上的抗药筛选标记转移至表达载体上，减少拯救载体的基础大小，扩大其容量，可介导在人疟原虫中敲入长达6.3kb外源基因片段，且获得的重组疟原虫不含抗药筛选标记和Cas9蛋白表达质粒的残留，可用同一药筛标记进行连续基因编辑，性能稳定，高效简洁，功能强大，具有广阔的应用前景和巨大的市场价值。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种基于CRISPR-Cas9技术的基因编辑系统及应用。

背景技术

基因编辑是利用人工核酸酶或“分子剪刀”对DNA进行插入、删除或替换的技术，包括第一代的ZFN锌指核酸酶技术，第二代的TALEN技术以及第三代的CRISPR/Cas9技术。CRISPR/Cas9技术具有设计简单、位点多、效率高、特异性好、耗时短等优点，是目前最热的基因编辑技术。CRISPR/Cas9系统主要元件有靶向靶基因的sgRNA(single guide RNA)和Cas9核酸酶。该系统的作用原理为Cas9核酸酶在sgRNA的引导下，在靶基因的特异位点进行切割，产生缺口。缺口产生后，细胞可以通过多种方式进行修复，主要包括经典的非同源末端(classical non-homologous end joining，NHEJ)修复和同源重组(homologousrecombination，HR)修复等。在没有模板的条件下，往往发生NHEJ修复，该修复过程会产生DNA的插入或缺失，造成移码突变，导致基因失活；在有同源模板情况下，可发生同源重组修复，实现对靶基因的精确编辑，如引入点突变或插入基因片段等；疟原虫缺乏非同源末端修复机制，其DNA缺口修复几乎完全依赖同源末端修复。

在恶性疟原虫(Plasmodium falciparum，Pf)中，目前有两种不同的CRISPR/Cas9技术系统可供选择，分别为内源U6启动子依赖(U6promoter dependent，U6Pd)型和外源T7启动子依赖(T7promoter dependent，T7Pd)型。U6Pd型系统采用了双质粒设计(Ghorbal，M.，et al.(2014).Genome editing in the human malaria parasite Plasmodiumfalciparum using the CRISPR-Cas9system.Nat Biotechnol 32(8):819-821.)，一个载体为Cas9蛋白表达载体，携带Cas9蛋白表达框和抗药筛选标记表达框，质粒大小为11096bp；另一个载体为sgRNA表达载体兼同源修复模板，携带sgRNA表达框、负筛选标记、抗药筛选标记和同源臂，sgRNA由Pf内源U6启动子表达，未加同源臂的质粒大小为9233bp。T7Pd型系统也采用了双质粒系统(Wagner J.C.，et al.(2014).Efficient CRISPR-Cas9-mediated genome editing in Plasmodium falciparum.Nat Methods 11(9):915-918)，一个质粒为Cas9蛋白表达载体，携带Cas9蛋白表达框、sgRNA表达框和抗药筛选标记表达框，其中sgRNA的转录由T7启动子启动，由于疟原虫体内无T7RNA聚合酶，因此sgRNA无法自主转录；另一个质粒是T7RNA聚合酶表达载体及同源臂携带载体，同时携带另一个抗药筛选标记。