[发明专利]一种提高酶稳定性的方法

说明书

本发明公开了一种提高酶稳定性的方法，属于酶技术领域。本发明的方法通过在酶的N端由连接肽(linker)连接双亲短肽(SAP)大大提高了酶的稳定性；利用本发明的方法制备得到的脂肪氧合酶在50℃保温30min后仍然保持初始酶活的95％以上，而相同条件下野生型LOX只保留初始酶活20％左右；利用该方法制备得到的碱性果胶酶在60℃保温30min后仍然保持初始酶活的97％以上，而相同条件下野生型LOX只保留初始酶活35％左右；利用该方法制备得到的天冬酰胺酶在在60℃保温30min后可保持初始酶活的120％以上，而相同条件下野生型LOX只保留初始酶活30％左右。

技术领域

本发明涉及一种提高酶稳定性的方法，属于酶技术领域。

背景技术

基于热稳定性对酶应用性能的重要影响，获得高热稳定性的酶一直是酶工程领域的研究热点。

目前，随着结构生物学与生物信息学的发展，研究者已经可以通过一些结构参数的分析(如B-因子、RMSF值等)或同源序列比对，较准确地定位影响酶分子热稳定性的氨基酸残基或肽段，进而对其进行定点突变提高酶的热稳定性。

尽管上述分子改造技术已成为酶热稳定性改造的常规策略，但是，它仍有其固有的技术缺陷，例如，定点突变的前提是获得准确的酶分子结构信息，体外定向进化则面临大量的突变体筛选，导致短时间内难以获得热稳定性明显提升的突变体。因此，建立一种高效、便捷的酶稳定化策略成为国内外研究者关注的焦点。

值得注意的是，日本大阪大学Urabe团队在研究嗜热脂肪芽孢杆菌过氧化氢酶的热稳定性时发现(Nat Biotechnol,1999,17(1):58-61)，融合短肽对酶的热稳定性影响明显；也有研究者在将过氧化氢酶C-端与不同长度和氨基酸序列的短肽随机融合时，得到了一系列高热稳定性的突变体；另外，大阪大学Kanaya团队发现C-端融合嗜热古菌核糖核酸酶C-端七肽(IGCIILT)，可以不同程度地提高不同来源的核糖核酸酶的热稳定性(PLoSONE,2011,6(1):e16226)。可见，融合短肽是一种极具潜力的提高酶热稳定性的手段。

SAPs是一类亲疏水氨基酸交替分布，能自发组装成纳米结构的短肽，其特有的两亲性质使得其在水中能形成水凝胶，从而对目的蛋白或其他小分子进行固定化。基于此，本研究室早前期研究中(Appl Microbiol Biot,2013,97(21):9419-9427)，将一类SAPs融合在酶N端进行融合酶异源表达时发现，SAPs具有提高酶表达量及稳定性的功能，其中，具有特殊电荷分布的S1(AEAEAKAKAEAEAKAK)具有一定的普适性效果；清华大学Lin等(FaradayDiscuss,2013,166:233)则发现，利用与S1氨基酸组成类似的SAP(LELELKLKLELELKLK)融合在酶末端，可促进生成活性包涵体，说明氨基酸组成对SAPs融合蛋白的分泌表达及稳定性有重要影响。因此，可尝试以SAPs为基础，得到一种提高酶热稳定性的方法。

发明内容

[技术问题]

本发明要解决的技术问题是得到一种提高酶热稳定性的方法。

[技术方案]

为解决上述问题，本发明提供了一种提高酶稳定性的方法，所述方法为在酶的N端通过连接肽(linker)连接双亲短肽(SAP)；

所述连接肽(linker)为包含刚性肽和柔性肽的组合单元；所述刚性肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1(EAAAK)所示；所述柔性肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.2(GGGGS)所示；

所述双亲短肽(SAP)为氨基酸序列如SEQ ID NO.3(ADADAKAKADADAKAK)或SEQ IDNO.4(ADADARARADADARAR)所示的短肽组成的重复单元；