[发明专利]一种发酵制备达托霉素的方法

说明书

本发明公开了一种发酵制备达托霉素的方法。在发酵培养过程中，其包含添加邻氨基苯甲酸和/或邻氨基苯甲酸盐的步骤。本发明从达托霉素的生物合成机制出发，探究影响其合成的生物分子，通过在在达托霉素发酵培养基中加入邻氨基苯甲酸和/或邻氨基苯甲酸盐后，可以显著提高达托霉素的产量，从而降低工业生产成本。

技术领域

本发明涉及一种发酵制备达托霉素的方法。

背景技术

色氨酸是达托霉素合成过程中最重要的氨基酸之一，其不仅是环肽合成的第一步，也是合成犬尿氨酸的前体物。而有一种物质与这两种氨基酸都有着莫大的关系，即邻氨基苯甲酸。

与色氨酸相关，邻氨基苯甲酸是色氨酸合成的前体物质。色氨酸由构成芳香族氨基酸的先导物分支酸合成，其生物合成途径包含5个连续的酶促反应。第一步反应包含分支酸和谷氨酰胺转运途径形成邻氨基苯甲酸，谷氨酸和丙酮酸。其催化需要邻氨基苯甲酸合成酶。后邻氨基苯甲酸再经四步反应生成色氨酸。TrpE和trpD基因分别编码邻氨基苯甲酸合成酶I和II(Journal of Biological Chemistry,1973,248(3):901-14)。扩增质粒中trp操纵子能够提高色氨酸的表达水平(Gene,1977,1(2):141)。TrpE^fbr突变体(解除了色氨酸终产物反馈抑制)能够在邻氨基苯甲酸存在使色氨酸的产量达到54.6g/L。其中，31.2g/L的色氨酸由邻氨基苯甲酸合成，而23.4g/L的色氨酸来源于葡萄糖(Applied MicrobiologyBiotechnology,1993,39(4-5):471-476)。

与犬尿氨酸相关，邻氨基苯甲酸是其代谢产物。在哺乳动物中，色氨酸经代谢生成L-犬尿氨酸；犬尿氨酸被犬尿氨酸单加氧酶催化，生成3-羟基邻氨基苯甲酸和L-丙氨酸(Journal of the American Chemical Society,2005,127(3):840-1)。而在大多数微生物中，犬尿氨酸经犬尿氨酸酶催化生成邻氨基苯甲酸(ChemistryBiology,2003,10(12):1195-1204)，即犬尿氨酸途径。如在CDA的产生菌S.coelicolor中，当将犬尿氨酸酶kynU敲除后，CDA的产量增加(ApplMicrobiolBlot,2012,94:719-728)；西南大学研究者在2012年确定了玫瑰胞链霉菌中存在犬尿氨酸途径。并且，当将犬尿氨酸酶基因kyn敲除后，达托霉素的产量提高了33％。

2013年，华中科技大学的杨夏露对达托霉素产生菌进行紫外诱变和原生质体融合处理，最终获得菌株产量达到1388mg/L(A21978C发酵条件优化及高产菌株选育[D].华中科技大学,2013)；上海医药工业研究院的吴远杰通过亚硝基胍诱变和二甲基硫抗性筛选，结合癸酸的添加，使菌株产量达到1680mg/L(达托霉素的菌种选育及补料发酵工艺[J].中国医药工业杂志,2013,44(9):864-867)；2015年，浙江大学的杨一恭通过菌种选育，使A21978C在摇瓶中的产量达到6952mg/L，发酵罐上通过对发酵参数的调控，在发酵的208h达托霉素的产量达到2498mg/L(达托霉素的菌种选育及发酵条件的优化研究[D].浙江工业大学,2015)。

目前提高达托霉素产量的方法，一般是向培养基中添加无机盐及氨基酸等，但对其生产的促进作用较小，且大多欠理论依托。现有技术中的达托霉素发酵产量低，不仅增加生产成本，也会大大增加后续分离纯化的难度。然而，目前国内的工业发酵水平还比较弱，达托霉素的价格较贵，对普通患者造成巨大的经济负担。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服目前提高达托霉素产量的方法，一般是向培养基中添加无机盐及氨基酸等，而且达托霉素产量较低的缺陷，提供了一种发酵制备达托霉素的方法。

本发明通过以下技术方案解决上述技术问题。

本发明提供了一种发酵制备达托霉素的方法，在发酵培养过程中，其包含添加邻氨基苯甲酸和/或邻氨基苯甲酸盐的步骤。