[发明专利]一种基于镧系核苷酸配合物和DNA定向固定技术构建人造多酶系统的方法

权利要求书

1.一种镧系核苷酸配位聚合物封装DNA定向固定化酶用于构建人造多酶系统的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将磁性纳米粒子Fe₃O₄@SiO₂表面采用含有氨基的硅烷偶联剂进行氨基化，采用的含有氨基的硅烷偶联剂为(3-氨丙基)三乙氧基硅烷(APTES)；

(2)将步骤(1)得到的氨基化磁性纳米粒子采用磷酸盐缓冲溶液和戊二醛溶液进行孵育，分离洗涤得到MNPs；

(3)将sspDNA采用buffer B涡旋至sspDNA完全溶解；将sspDNA溶液加入到步骤(2)得到的MNPs中，再加入PBS，在37℃的摇床中反应3.5h；将产物用buffer A洗涤，再加入牛血清白蛋白(BSA)溶液，反应30min，对MNPs表面的非特异性结合位点进行封闭，反应后，将得到的MNPs@sspDNA洗涤，并浸泡在buffer B中，在4℃下保存备用，得到sspDNA功能化的磁性纳米粒子；

(4)(a)将sscDNA采用buffer B涡旋至DNA完全溶解，再加入三(2-羧乙基)膦(TCEP)水溶液，在25℃的摇床中反应1h；反应结束后，混合物用3K超滤离心管过滤洗涤除去未参加反应的sscDNA；

(b)称取GOx溶于buffer B中，涡旋混合均匀；称取4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐(suflo-SMCC)超声溶解于buffer B中，并将其加入到上述GOx溶液中，涡旋混合均匀；将混合液放置于摇床中，在25℃、反应1h，反应结束后，混合物用10K超滤离心管过滤洗涤除去未参加反应的sulfo-SMCC；

(c)将步骤(b)过滤好的GOx溶液与步骤(a)所得的sscDNA溶液混合在一起，在37℃的摇床中反应48h；反应结束后，混合物用10K超滤离心管过滤洗涤除去未反应完全的sscDNA，得到的GOx-sscDNA共轭物保存在4℃下备用，得到sscDNA修饰的葡萄糖氧化酶；

(5)将单链DNA修饰的磁性纳米粒子、GOx-sscDNA共轭物和buffer B在37℃400rpm摇床中反应3h，反应结束后，洗涤得到的通过DNA定向固定技术固定的葡萄糖氧化酶即固定化酶浸泡在buffer B中，保存在4℃下备用；

(6)将步骤(5)中合成的固定化酶与六水合硝酸铈、5'-腺嘌呤核苷酸二钠盐及bufferC混合反应，用buffer C润洗，得到镧系核苷酸配位聚合物封装的人造多酶系统；

步骤(3)中所述的sspDNA的序列为5′-NH2-CTTGACTTCATCGAGGTCCAGTCA-3′，步骤(4)中sscDNA的序列为5′-SH-TGACTGGACCTCGATGAAGTCAAG-3′。

2.按照权利要求1所述的一种镧系核苷酸配位聚合物封装DNA定向固定化酶用于构建人造多酶系统的方法，其特征在于，sspDNA和sscDNA的使用量为每0.5OD，溶解在150μL的buffer A中。

3.按照权利要求1所述的一种镧系核苷酸配位聚合物封装DNA定向固定化酶用于构建人造多酶系统的方法，其特征在于，步骤(5)中sspDNA功能化的磁性纳米粒子与sscDNA修饰的葡萄糖氧化酶加入量质量比为25:2。

4.按照权利要求1所述的一种镧系核苷酸配位聚合物封装DNA定向固定化酶用于构建人造多酶系统的方法，其特征在于，步骤(6)中固定化酶的加入量和浓度分别为200μL、1mg/mL；六水合硝酸铈的加入量和浓度分别为100μL、50mM；5'-腺嘌呤核苷酸二钠盐的加入量和浓度分别为200μL、25mM。

5.按照权利要求1所述的一种镧系核苷酸配位聚合物封装DNA定向固定化酶用于构建人造多酶系统的方法，其特征在于，所述的buffer A为磷酸盐缓冲溶液，10mM，pH 7.4，0.1MNaCl；buffer B为磷酸盐缓冲溶液，10mM，pH 7.4，0.1M NaCl，0.05wt％Tween-20；buffer C为4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲溶液，pH 7.4，25mM。