[发明专利]一种基于镧系核苷酸配合物和DNA定向固定技术构建人造多酶系统的方法

说明书

一种基于镧系核苷酸配合物和DNA定向固定技术构建人造多酶系统的方法，属于固定化酶制备领域。本发明分为以下步骤：首先制备单链DNA修饰的磁性纳米粒子和互补单链DNA功能化的葡萄糖氧化酶；之后将磁性纳米粒子与酶混合，通过DNA互补杂交实现酶的固定化；将固定化酶与六水合硝酸铈和5'‑腺嘌呤核苷酸二钠盐共同孵育，通过镧系核苷酸配位聚合物的自组装实现对固定化酶的封装，构建人造多酶系统。封装载体不仅可以起到保护固定化酶的作用，还作为模拟酶，与固定的天然酶组成酶级联系统。本发明的人造多酶系统制备过程简单且条件温和，酶活性高，易于从反应体系中分离，稳定性和重复使用性优异，同时通过引入模拟酶，极大地降低了成本。

技术领域

本发明属于固定化多酶系统制备技术领域，具体涉及通过双链DNA互补介导技术固定酶和镧系核苷酸配位聚合物封装酶的方法。

背景技术

酶是高效的生物催化剂，具有很高的底物特异性和温和的反应条件。在生物体中，通常由多种不同的酶组成多酶系统，以通过级联催化反应实现多种生理过程。受到自然界的启发，研究人员致力于开发人造多酶系统，其中天然酶或纳米模拟酶被共同固定，以实现复杂的功能。然而，固定在载体上的酶通常难以受到载体的保护，受到其在非生理环境下快速失活的限制，在恶劣的反应条件下十分脆弱，导致了稳定性差，成本高和催化效率低等问题。对固定化酶进行封装，利用外部涂层对酶的“屏蔽效应”，可以有效地保护酶。封装的DNA定向固定化酶具有以下优点：其一，分离容易，可以实现对酶的回收利用，同时避免了酶对反应底物的污染；其二，封装固定化酶可以增加酶的稳定性，提高酶的重复使用性，扩展其工业化应用；其三，通过DNA定向固定的酶可以保持其活性位点完全暴露，解决了封装酶通常存在的活性下降的问题；其四，通过合理的设计，用于封装的保护涂层还可以作为模拟酶，和天然酶组成级联系统，从而减少酶的使用，大幅度降低了应用成本。

由于核苷酸配位聚合物具有较好的生物相容性、物理化学稳定性和多孔性，同时其聚合条件相对温和，已经被广泛应用于化学和生物领域。近年来，以核苷酸配位聚合物为载体进行生物客体分子的包覆得到发展。尽管配位聚合物已经被证明对酶具有良好的封装率，固定效果满意，但此类固定化酶难以从反应体系中分离，重复使用性较差，活性和稳定性也存在很大问题。因此，需要进一步研究高活性、高稳定性和易于分离的封装固定化酶用于构建人造多酶系统。

发明内容

本发明的目的是提供一种采用镧系核苷酸配位聚合物为封装载体用于保护通过双链DNA互补介导法固定到磁性纳米粒子上的酶的方法，以克服固定化酶在复杂外界环境下易失活的缺点，该封装载体不仅起到保护天然酶的作用，还能作为模拟酶，与固定化酶组成酶级联，从而构建人造多酶系统。本发明的人造多酶系统制备简单，条件温和，酶活性高，稳定性和重复使用性好，且易于从反应体系中分离。

该方法首先通过DNA定向固定化技术将葡萄糖氧化酶(GOx)固定到磁性纳米粒子的表面，再将其与六水合硝酸铈和5'-腺嘌呤核苷酸二钠盐(AMP)共同孵育，依靠镧系核苷酸配位聚合物的自组装实现对固定化酶的封装，构建人造多酶系统。

为了达到上述目的，本发明按照以下技术方案实现:

一种镧系核苷酸配位聚合物封装DNA定向固定化酶用于构建人造多酶系统的方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)将磁性纳米粒子Fe₃O₄@ SiO₂表面采用含有氨基的硅烷偶联剂进行氨基化，优选含有氨基的硅烷偶联剂为(3-氨丙基)三乙氧基硅烷(APTES)；

(2)将步骤(1)得到的氨基化磁性纳米粒子采用磷酸盐缓冲溶液和戊二醛溶液进行孵育，分离洗涤得到MNPs；