[发明专利]表达L-谷氨酸氧化酶和过氧化氢酶的重组载体、工程菌及应用与α-酮戊二酸的生产方法有效
| 申请号： | 201910030458.4 | 申请日： | 2019-01-11 |
| 公开（公告）号： | CN109679979B | 公开（公告）日： | 2023-03-17 |
| 发明（设计）人： | 王苓;李晚军;伍万兵;曾帅;刘鑫 | 申请（专利权）人： | 四川吉晟生物医药有限公司 |
| 主分类号： | C12N15/70 | 分类号： | C12N15/70;C12P7/50 |
| 代理公司： | 北京超凡志成知识产权代理事务所(普通合伙) 11371 | 代理人： | 孙海杰 |
| 地址： | 614000 四*** | 国省代码： | 四川;51 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 表达 谷氨酸 氧化酶 过氧化氢酶 重组 载体 工程 应用 酮戊二酸 生产 方法 | ||
1.一种α-酮戊二酸的生产方法，其特征在于，所述生产方法包括以下步骤：
构建表达L-谷氨酸氧化酶和过氧化氢酶的重组载体，将所述重组载体转化感受态细胞，得到工程菌；
所述工程菌经过初级培养得到发酵菌体；
将所述发酵菌体接种于生物反应器的反应液中进行反应，生产得到α-酮戊二酸；
其中，所述重组载体包括表达L-谷氨酸氧化酶的L-谷氨酸氧化酶基因LGOX、表达过氧化氢酶的过氧化氢酶基因CAT以及调控所述L-谷氨酸氧化酶基因LGOX和所述过氧化氢酶基因CAT表达的调控序列SD；所述L-谷氨酸氧化酶基因LGOX的碱基序列如SEQ ID No.1所示，所述过氧化氢酶基因CAT的碱基序列如SEQ ID No.2所示，所述调控序列SD的碱基序列如SEQ ID No.3所示；
所述初级培养包括一级培养和二级培养，所述一级培养的条件为37℃的温度条件下，220-250rpm培养8-12h；所述一级培养至OD600为3.8-4.1转接进行所述二级培养，所述二级培养的条件为37℃的温度条件下，200-235rpm培养4-5h；
二级培养后还包括补充培养，所述补充培养是将所述二级培养的菌液转接至发酵培养基进行发酵，所述发酵培养基的pH和/或溶氧上升，添加补料培养基，培养至OD600达到22-28时，开始降温至29-30℃，加入0.1～0.2mM的IPTG诱导培养11-14h，得到发酵菌体；
所述一级培养基为LB培养基，所述二级培养基为TB培养基，所述发酵培养基含有酵母膏28g/L，蛋白胨15g/L，甘油10g/L，三水合磷酸氢二钾16.4g/L，磷酸二氢钾2.3g/L，七水合硫酸镁0.3g/L，柠檬酸铁铵0.1g/L；所述补料培养基含有酵母膏100g/L，蛋白胨30g/L，甘油400g/L；
所述发酵菌体与所述反应液的料液比为20-35g/L；
所述反应液包括谷氨酸盐，所述生物反应器的所述反应液的温度为30℃的温度，260-320rpm，并控制pH为6.5-7.0。
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