[发明专利]表达L-谷氨酸氧化酶和过氧化氢酶的重组载体、工程菌及应用与α-酮戊二酸的生产方法

说明书

本发明提供了表达L‑谷氨酸氧化酶和过氧化氢酶的重组载体、工程菌及应用与α‑酮戊二酸的生产方法，属于分子生物技术及酶工程领域。本发明提供的表达L‑谷氨酸氧化酶和过氧化氢酶的重组载体，通过在载体中插入调控所述L‑谷氨酸氧化酶基因LGOX和过氧化氢酶基因CAT表达的调控序列SD，提高L‑谷氨酸氧化酶和过氧化氢酶转化底物生成α‑酮戊二酸的能力，具有较好的实际使用价值。

技术领域

本发明涉及分子生物技术及酶工程领域，具体而言，涉及表达L-谷氨酸氧化酶和过氧化氢酶的重组载体、工程菌及应用与α-酮戊二酸的生产方法。

背景技术

α-酮戊二酸是生物体三羧酸循环和氨基酸代谢的关键节点，可通过谷氨酸脱氢酶加氨或转氨酶生成谷氨酸，广泛运用于膳食、医疗、化妆品、精细化工等领域，甚至体育运动领域也将其作为减轻氨积累伤害的辅助类补品，市场需求大于供给，价格较高。目前合成α-酮戊二酸主要有三种方法：有机化学合成、发酵积累和酶法转化。

有机合成传统的方法有酰基腈化物水解法、草酸类乙酯水解法，需几步才能到达，较为繁琐，污染严重；发酵积累法已经取得较大突破，葡萄糖培养光滑球拟酵母积累α-酮戊二酸，64h达到43.7g/L；用甘油培养解脂耶氏酵母，117h达到186g/L，虽然产量已经很高，但其他杂酸较多，分离纯化难度大，且发酵周期过长，尚未实现工业化生产。

发明内容

本申请实施例提供了一种表达L-谷氨酸氧化酶和过氧化氢酶的重组载体、工程菌及应用与α-酮戊二酸的生产方法，通过构建高效表达的重组载体，方便生产；通过重组载体获得工程菌，方便进行全细胞催化，通过工程菌催化转化的方法能提高α-酮戊二酸的得率。

在本申请的第一方面，提供了表达L-谷氨酸氧化酶和过氧化氢酶的重组载体，重组载体包括表达L-谷氨酸氧化酶的L-谷氨酸氧化酶基因LGOX、表达过氧化氢酶的过氧化氢酶基因CAT以及调控L-谷氨酸氧化酶基因LGOX和过氧化氢酶基因CAT表达的调控序列SD；L-谷氨酸氧化酶基因LGOX的碱基序列如SEQ ID No.1所示，过氧化氢酶基因CAT的碱基序列如SEQ ID No.2所示，调控序列SD的碱基序列如SEQ ID No.3所示。

通过共表达L-谷氨酸氧化酶和过氧化氢酶转化谷氨酸盐生产α-酮戊二酸的原理如下：

通过L-谷氨酸氧化酶转化谷氨酸盐为α-酮戊二酸，同时产生过氧化氢，随着反应的进行过氧化氢的浓度会增加，就会抑制反应的进行，所以通过过氧化氢酶的作用，降解过氧化氢并生成水和氧气，保证反应的持续有效进行。

本实施例中通过在表达载体中调控L-谷氨酸氧化酶基因LGOX和过氧化氢酶基因CAT表达的调控序列SD，调控序列SD具有核糖体结合的位点并调控L-谷氨酸氧化酶基因LGOX和过氧化氢酶基因CAT表达，达到L-谷氨酸氧化酶和过氧化氢酶的表达量的配合平衡，实现较佳的反应速率，提高α-酮戊二酸的产率。

本申请的第二方面，提供了上述的表达L-谷氨酸氧化酶和过氧化氢酶的重组载体在制备α-酮戊二酸中的应用。

本申请的第三方面，提供了表达L-谷氨酸氧化酶和过氧化氢酶的工程菌，工程菌包括表达L-谷氨酸氧化酶的L-谷氨酸氧化酶基因LGOX、表达过氧化氢酶的过氧化氢酶基因CAT以及调控L-谷氨酸氧化酶基因LGOX和过氧化氢酶基因CAT表达的调控序列SD；L-谷氨酸氧化酶基因LGOX的碱基序列如SEQ ID No.1所示，过氧化氢酶基因CAT的碱基序列如SEQ IDNo.2所示，调控序列SD的碱基序列如SEQ ID No.3所示。

本申请的第四方面，提供了上述的表达L-谷氨酸氧化酶和过氧化氢酶的工程菌在制备α-酮戊二酸中的应用。

本申请的第五方面，提供了一种α-酮戊二酸的生产方法，生产方法包括以下步骤：

构建表达L-谷氨酸氧化酶和过氧化氢酶的重组载体，将重组载体转化感受态细胞，得到工程菌；