[发明专利]一种小鼠肝脏原代细胞培养基、培养方法及培养箱

说明书

本发明提供了一种小鼠肝脏原代细胞培养基及培养方法，培养基配方为：William’s E培养基，牛血清白蛋白，胰岛素，和地塞米松，L‑谷氨酰胺，青霉素，链霉素。培养方法为：使用所述小鼠肝脏原代细胞培养基进行小鼠肝脏原代细胞的培养。本发明的培养基完全可以满足原代肝脏细胞的生长需求，细胞生长状态良好，且培养基配制简单，成本低，具有快速、经济、高效的优点。本发明的培养方法在所有阶段均未使用胎牛血清，避免了血清的复杂成分对小鼠原代肝脏细胞造成的影响。本发明还提供了一种改进的细胞培养箱。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种小鼠肝脏原代细胞培养基、培养方法及培养方法中使用到的培养箱。

背景技术

来源于肝脏经特殊分离方法制备而来的原初培养的肝脏细胞称之为原代肝细胞。将小鼠的肝脏从机体中取出，经胰酶、螯合剂(常用EDTA)处理，分散成单细胞，用肝脏组织制备的细胞以肝细胞为主，但是还有胆管上皮细胞，星形细胞，肝血窦内皮细胞，血细胞等需要清除，通过一定大小的网筛筛选，合适的转速离心，同时置于合适的培养基中培养筛选，最终才能获得高纯度的肝细胞。

高纯度的肝脏原代细胞在研究肝脏的生物学实验中使用非常广泛，是肝脏分子生物学研究中的重要工具细胞，因此研发一个性价比高，使用效果好的原代肝脏细胞培养基具有重要的意义。

现有的肝脏原代细胞的培养基主要是购买国外品牌赛默飞世尔科技旗下的HepatoZYME-SFM无血清培养基，此外添加胎牛血清等维持原代肝脏细胞的生长和性能。例如《热带医学杂志》2008年第10期论文“改良原代大鼠肝细胞的体外分离培养和功能研究”使用含有胎牛血清的HepatoZYME-SFM培养原代大鼠肝细胞；《世界华人消化杂志》2011年第19期论文“成人原代肝细胞的分离、培养及冻存”使用含胎牛血清和DMSO的HepatoZYME-SFM培养成人原代肝细胞。

现存在的问题：HepatoZYME-SFM无血清培养基货品价格昂贵且用量很大，在肝脏原代细胞的培养中造成了很多的不便。而且胎牛血清成分复杂，对原代细胞的生长具有许多不确定的影响因素，尤其是胎牛血清中高含量的内毒素、多胺氧化酶和血清中所含的抗体、补体以及可能含有的支原体、病毒等对原代肝脏细胞的生长具有毒害作用。此外胎牛血清中含有的成份、含量及其作用机制仍不清楚，尤其是其中的一些多肽类生长因子、激素和脂类的对细胞的影响尚未充分认识，此外其中含有的众多激素可诱导小鼠原代肝脏细胞的异形性分化，导致小鼠原代肝脏细胞的性状改变，从而使获得高标准的肝脏原代细胞受到限制。

《癌变·畸变·突变》2016年第28期论文“原代小鼠肝细胞培养方法的比较”比较了3种不同培养条件下原代小鼠肝细胞的形态以及肝细胞功能，寻找适合于原代小鼠肝细胞体外培养的培养基配方。具体的小鼠原代肝细胞培养方法为：小鼠原代肝细胞以1.0×10⁵/cm²的细胞密度接种于包被有鼠尾胶原的培养板内，使用贴壁培养基(William’s E培养基、体积分数为10％的胎牛血清、1μmol/L地塞米松、4μg/mL牛胰岛素、2mmol/L L-谷氨酰胺，100U/ml青霉素、100μg/mL链霉素，15mmol/L HEPES)在37摄氏度，体积分数为5％的CO₂培养箱内培养4小时后，将培养基吸出，铺上层胶原，形成三明治结构，2小时后分为3组分别加入不同的无血清培养基来维持肝细胞生长。3组的培养基分别为基础培养基、基础培养基加DMSO(DMSO组)、基础培养基加DMSO和EGF(DMSO+EGF组)，其中基础培养基为：William’s E培养基、0.1μmol/L地塞米松、4μg/mL牛胰岛素、2mmol/L L-谷氨酰胺，100U/ml青霉素、100μg/mL链霉素，15mmol/L HEPES，结果表明小鼠原代肝细胞培养基中加入DMSO对于维持肝细胞的形态和功能有促进作用。