[发明专利]一种快速高效的落地生根毛状根诱导和扩繁方法

说明书

本发明提供一种快速高效的落地生根毛状根诱导和扩繁方法，包括：（1）将无菌的落地生根外植体用野生型和含有GUS报告基因A4农杆菌侵染液侵染；（2）侵染后的外植体置于无抗MS固体培养基上，黑暗条件下进行共培养，再在有抗MS固体培养基中进行共培养；(3)在有抗MS固体培养基上进行筛选培养，（4）在有抗MS固体培养基上进行继代培养；（5）在MS液体培养基上进行扩大培养；(6)对含有GUS报告基因的毛状根进行GUS染色探究转化效率。本发明方法适用于多种落地生根品种毛状根的诱导，具有取材方便、适用性强、操作简便、诱导速度快、遗传稳定及节约成本等优点。

技术领域

本发明涉及农业生物技术研究领域，特别是提供一种对落地生根的毛状根进行快速诱导和扩繁，并对调控落地生根相关性状基因的转化提供了快速准确的研究方法。

背景技术

落地生根(Bryohyllm pinnatum)又名灯笼花，隶属景天科(Crassulaceae)落地生根属(Bryohyllm)，为多年生肉质草本植物，是一种重要的中药材，全草可入药, 可解毒消肿，活血止痛，拔毒生肌， 其中含有大量丰富的化学成分, 除具有观赏价值外, 还具有广泛的药理作用, 具有巨大的开发应用价值。在落地生根的繁育和开发研究中，对落地生根中基因的克隆和基因功能验证就尤为重要。研究表明，落地生根在进行基因功能验证的方法中，一般采用拟南芥或者诱导愈伤再生，生长周期较长且转化效率较低。因此对落地生根毛状根进行快速诱导和提高基因转化效率十分必要。

落地生根外植体用发根农杆菌诱导，其中发根农杆菌菌种是关键物质。A4是发根农杆菌的一种，已有文献报道可以利用A4农杆菌诱导植物发根。发根农杆菌诱导植物产生毛状根是一个复杂的过程，与之含有的Ri质粒有着密切的关系，主要是由Ri质粒中Ori区、Vir区及T-DNA区三部分共同作用的结果。本发明研究了A4发根农杆菌对落地生根的诱导时间和浓度，培养时间等，并且构建了转化的带有GUS报告基因的A4发根农杆菌，和对转化的毛状根进行了GUS染色。通过实验研究发现野生型和转化的A4发根农杆菌最合适的OD 600值，能使落地生根高效诱导出毛状根，并能带有GUS基因而染成蓝色。

发明内容

本发明的目的在于提供一种直观、经济、简便的快速诱导落地生根毛状根以及提高转基因效率的方法，以便应用于落地生根毛状根诱导，构建了转化的带有GUS报告基因的A4发根农杆菌，并对转化的毛状根进行了GUS染色鉴定以探究转化效率。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：一种快速高效的落地生根毛状根诱导和扩繁方法，包括以下步骤：

（1）将无菌的2-3周龄的外植体（落地生根苗）分别用侵染液A和侵染液B侵染处理5-10分钟，所述侵染液A为野生型A4发根农杆菌，侵染液B为转入GUS报告基因的A4发根农杆菌；

（2）将侵染后的外植体置于无抗MS固体培养基上，黑暗条件下进行共培养24-48小时；

（3）将外植体转移到有抗MS固体培养基中进行共培养，2-3周以后外植体分化形成毛状根；

（4）剪下毛状根，在有抗MS固体培养基上进行筛选培养，两周以后筛选出生长速度快的落地生根毛状根；

（5）再在有抗MS固体培养基上进行继代培养，得到脱毒的落地生根毛状根；

（6）剪取毛状根，在MS液体培养基上进行扩大培养，得到大量的落地生根毛状根；

（7）用B侵染液诱导出的落地生根毛状根进行GUS染色探究转化效率。

作为更为具体的实施方式，步骤（1）中，所述侵染液A由50 ml OD 600值为0.8的农杆菌A4进行离心，用等体积MS液体进行重悬得到。

作为更为具体的实施方式，步骤（1）和步骤（7）中，所述侵染液B由50 ml OD 600值为0.8带有GUS报告基因的农杆菌A4进行离心，用等体积MS液体进行重悬得到。