[发明专利]细胞外囊泡的分离方法、以及检测细胞外囊泡表面标志物的方法和试剂盒

说明书

本发明提供了一种细胞外囊泡的分离方法、以及检测细胞外囊泡表面标志物的方法和试剂盒，该分离方法包括：将预处理后的生物样品与磷脂酰丝氨酸捕获分子‑亲和标签融合蛋白混合孵育后，再加入固相载体，形成载体‑细胞外囊泡复合物；再将载体‑细胞外囊泡复合物从生物样品中分离。该检测方法包括：将上述所得的载体‑细胞外囊泡复合物与标志物抗体混合孵育，得到载体‑细胞外囊泡‑荧光素酶复合物；裂解载体‑细胞外囊泡‑荧光素酶复合物，进行发光检测。该方法对细胞外囊泡的分离效率高、特异性强，且检测时的灵敏度高。此外，通过选择不同底物或不同波长的荧光素酶，实现两种及以上标志物的同时检测。

技术领域

本发明涉及生物监测领域，具体而言，涉及一种细胞外囊泡的分离方法、以及检测细胞外囊泡表面标志物的方法和试剂盒。

背景技术

细胞外囊泡，是指由脂质双分子层包绕形成的球状膜性囊泡，其由细胞天然分泌并进入体液循环的微小囊泡，包括外泌体、膜微粒、微囊泡及凋亡小体等。这些细胞外囊泡的表面携带了许多能够预测疾病或反映疾病进程的蛋白标志物，是实现液体活检的重要检测对象。然而，细胞外囊泡在血液中的半衰期只有几个小时，同时来自病变组织的细胞外囊泡占比很小，因此需要极高灵敏的方法进行检测。

目前常采用的一种检测方法为:采用CD63、CD81等细胞外囊泡特异性抗体，从样品中捕获细胞外囊泡，再依次加入生物素标记的标志物抗体、链霉亲和素-辣根过氧化物酶和底物，进行酶促显色检测。然而，由于采用CD63、CD81等特异性抗体从样品中捕获细胞外囊泡的效率有限，且细胞外囊泡表面标志物的含量及其微小，导致这种酶促显色检测的灵敏度有限，不能对其进行准确检测。

鉴于此，特提出本申请。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种细胞外囊泡的分离方法，这种方法通过利用磷脂酰丝氨酸捕获分子特异性的结合细胞外囊泡的磷脂酰丝氨酸来捕获细胞外囊泡，分离效率高、特异性强。

本发明的第二目的在于提供一种细胞外囊泡表面标志物的检测方法，该方法通过利用偶联有荧光素酶的标志物抗体实现细胞外囊泡表面标志物的定量检测，灵敏度高。

本发明的第三目的在于提供一种用于检测细胞外囊泡表面标志物的试剂盒。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

一种细胞外囊泡的分离方法，其包括：

将预处理后的生物样品与磷脂酰丝氨酸捕获分子-亲和标签融合蛋白混合孵育后，再加入能与磷脂酰丝氨酸捕获分子-亲和标签融合蛋白中的亲和标签特异性结合的固相载体，形成载体-细胞外囊泡复合物；

再将载体-细胞外囊泡复合物从生物样品中分离。

一种细胞外囊泡表面标志物的检测方法，其包括：

将采用权利要求1～5任一项的分离方法得到的载体-细胞外囊泡复合物与偶联有荧光素酶的标志物抗体混合孵育，得到载体-细胞外囊泡-荧光素酶复合物；

裂解载体-细胞外囊泡-荧光素酶复合物，并加入荧光素酶的底物，检测荧光素酶催化的发光强度。

一种用于检测细胞外囊泡表面标志物的试剂盒，其包括：荧光素酶-抗体融合蛋白、磷脂酰丝氨酸捕获分子-亲和标签融合蛋白以及固相载体。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

相比于现有技术中采用CD63、CD81等细胞外囊泡特异性抗体从样品中捕获细胞外囊泡的方法，本申请中提供的这种细胞外囊泡的分离方法，通过利用磷脂酰丝氨酸捕获分子特异性的结合细胞外囊泡的磷脂酰丝氨酸来捕获细胞外囊泡，由于细胞外囊泡表面的的磷脂酰丝氨酸的含量远多于CD63、CD81等分子，本发明的这种方法的分离效率高、特异性强。