[发明专利]一种用于制备抗EGFR全人源化单克隆抗体的细胞株构建方法在审
| 申请号： | 201910035505.4 | 申请日： | 2019-01-15 |
| 公开（公告）号： | CN109988751A | 公开（公告）日： | 2019-07-09 |
| 发明（设计）人： | 李明丽;李明轩;尹春光;魏衍刚 | 申请（专利权）人： | 济宁学院 |
| 主分类号： | C12N5/20 | 分类号： | C12N5/20 |
| 代理公司： | 北京太兆天元知识产权代理有限责任公司 11108 | 代理人： | 王宇 |
| 地址： | 272001 山*** | 国省代码： | 山东;37 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 细胞株 整合 单克隆抗体 重链基因 培养基 表达量 筛选 构建 源化 制备 人源化单克隆抗体 中国仓鼠卵巢细胞 二氢叶酸还原酶 稳定细胞株 细胞 抗体活性 克隆筛选 轻链基因 产业化 基因组 拷贝数 脱糖 转染 生产工艺 | ||
1.一种用于制备抗EGFR全人源化单克隆抗体的细胞株构建方法，其特征在于，在中国仓鼠卵巢细胞二氢叶酸还原酶缺陷株CHO/DHFR-的细胞完成转染步骤后的POOL筛选步骤中，第一阶段利用不含HT的SFM4CHO培养基对整合重链基因的细胞株进行筛选，同时利用培养基中的Blasticidin筛选出整合有轻链基因的细胞株；第二阶段加入MTX以增加整合进细胞株基因组的轻、重链基因拷贝数以提高表达量。
2.根据权利要求1所述的用于制备抗EGFR全人源化单克隆抗体的细胞株构建方法，其特征在于，POOL筛选步骤中，第一阶段，培养基中GlutaMAX-I浓度为4mM，Blasticidin浓度为10mg/l，每周两次进行传代到细胞活率恢复到85％以上；第二阶段，培养基中GlutaMAX-I浓度为4mM，Blasticidin浓度为10mg/l，MTX浓度为500nM，每周两次传代到细胞活率恢复到90％以上。
3.根据权利要求2所述的用于制备抗EGFR全人源化单克隆抗体的细胞株构建方法，其特征在于，POOL筛选步骤完成后进行克隆扩增，使用2X103补料培养，2X103补料中FM012浓度为50g/l，每次补料将糖补至终浓度10-12g/l。
4.根据权利要求3所述的用于制备抗EGFR全人源化单克隆抗体的细胞株构建方法，其特征在于，补料培养后进行铺板培养，将细胞按300cells/ml的密度计算相应的细胞量加入含有半固体培养基的离心管中混匀后铺板，每孔体积2.5ml，移入到温度36.5℃，6％CO2恒温培养箱中静置培养。
5.根据权利要求4所述的用于制备抗EGFR全人源化单克隆抗体的细胞株构建方法，其特征在于，铺板培养使用的半固体培养基配制方法为：将90ml CloneMedium CHO DHFR于铺板前24小时从-40℃取出放于2-8℃冰箱，将2ml GlutaMAX-I、1ml Clone Detectantihuman FITC、2ml Clone XL Reagent加入到预备的CloneMedium CHO DHFR中，再加入MTX和Blasticidin，使其在终体积100ml时浓度分别为500nM和10mg/l，并且用宿主细胞上清将体积调至到100ml。
6.根据权利要求5所述的用于制备抗EGFR全人源化单克隆抗体的细胞株构建方法，其特征在于，构建过程中的细胞培养条件:温度36.5℃，湿度75％至85％，二氧化碳浓度6％，旋转半径2.5cm，转速110至225rmp，体积20至30ml。
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