[发明专利]一种用于制备抗EGFR全人源化单克隆抗体的细胞株构建方法

说明书

本发明公开了一种用于制备抗EGFR全人源化单克隆抗体的细胞株构建方法，在中国仓鼠卵巢细胞二氢叶酸还原酶缺陷株CHO/DHFR‑的细胞完成转染步骤后的POOL筛选步骤中，第一阶段利用不含HT的SFM4CHO培养基对整合重链基因的细胞株进行筛选，同时利用培养基中的Blasticidin筛选出整合有轻链基因的细胞株；第二阶段加入MTX以增加整合进细胞株基因组的轻、重链基因拷贝数以提高表达量。首次克隆筛选出适合大试生产工艺的表达量达2.0g/L‑3.0g/L的高效稳定细胞株，产品SEC、pI‑cIEF、脱糖分子量、基于细胞的抗体活性显著提升，为重组抗EGFR人源化单克隆抗体在国内实现产业化提供可能。

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及一种用于制备抗EGFR全人源化单克隆抗体的细胞株构建方法。

背景技术

单克隆抗体(monoclonal antibody，mAb)是由单一B细胞克隆产生的具有高度均一、仅针对某一特定抗原表位的抗体，具有特异靶向性，适应症主要集中在肿瘤、自身免疫性疾病、感染性疾病等方面。自1997年全球第一个治疗性单克隆抗体Rituxin由FDA批准上市以来，短短20年间单克隆抗体迅速在全球的生物医药领域迅猛发展，成为近年来研究热点之一。

近年来，国内也涌现出一批研究治疗性单克隆抗体药物的企业和研究机构，其中以表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)为靶标的治疗性抗体尤为关注。EGFR是一种跨膜糖蛋白，在实体瘤中呈现高表达。EGFR表达阳性的肿瘤具有恶性度高、侵袭力强的特点，且EGFR表达水平的高低与预后相关，因而成为当前肿瘤分子靶向治疗的一个重要靶点。以EGFR为靶标的单克隆抗体药物，能与内源性配体竞争结合EGFR，通过抑制酪氨酸激酶的激活、促进EGFR内化等作用产生抗肿瘤效应。

目前国内外已有3种抗EGFR单克隆抗体上市，与其他化疗药相比，具有靶点明确、疗效显著、毒副作用低等特点，在临床上取得了较好的疗效。最早上市的抗EGFR单克隆抗体是2004年被美国FDA(the Food and Drug Administration)批准的西妥昔单抗，是一种重组的抗EGFR人鼠嵌合单克隆抗体，用于治疗转移性结肠癌，该产品已于2009年获批进入在国内上市，中文商品名：爱必妥；帕尼单抗是第一个重组抗EGFR全人源化单克隆抗体，用于晚期结直肠癌的治疗，其免疫原性较西妥昔单抗等嵌合单抗更低，潜在的临床应用副作用更低。目前帕尼单抗已在欧美、日本等40多个国家批准上市，但国内所需依然依赖进口，进口原研药价格昂贵，限制了多数结直肠癌患者治愈的机会。

当前国内已有研究机构和药企联合开发帕尼单抗生物类似药。但生物类似药的研发不同于化学仿制药的研发，相比较而言，生物类似药的研发具有相当的技术门槛。每一生产步骤的微小改变均会对终产物的表达量或活性造成影响；高表达细胞株和细胞培养工艺开发、蛋白纯化工艺和过程控制、抗体药物的质量标准等，都限制着生物类似药研发及产业化。

发明内容

为解决现有技术存在的局限和缺陷，本发明以原研药帕尼单抗作为参考对照，构建高表达细胞株，研发中试规模培养和纯化工艺，以获取原研药性状、功能相似的重组抗EGFR人源化单克隆抗体。本发明通过POOL构建，批次补料实验筛选及铺板、克隆挑取、HTRF、克隆扩增、克隆批次补料实验，筛选出高表达Vectibix的稳定细胞株。通过工艺优化表达量达2.05g/L，产品SEC、pI-cIEF、脱糖分子量、基于细胞的抗体活性获得显著提升。

一种用于制备抗EGFR全人源化单克隆抗体的细胞株构建方法，其特征在于，在中国仓鼠卵巢细胞二氢叶酸还原酶缺陷株CHO/DHFR-的细胞完成转染步骤后的POOL筛选步骤中，第一阶段利用不含HT的SFM4CHO培养基对整合重链基因的细胞株进行筛选，同时利用培养基中的Blasticidin筛选出整合有轻链基因的细胞株；第二阶段加入MTX以增加整合进细胞株基因组的轻、重链基因拷贝数以提高表达量。